III. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian 1.1. Bahan Materi yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanah dari rizosfer tanaman Cabai merah (Capsicum annum L.) yang terdapat di Desa Sumbang, Kecamatan Sumbang, Kabupaten Banyumas, media PDA, alkohol 70 %, akuades, Kloramfenikol 1.2. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan Petri, tabung Erlenmeyer, beaker glass, tabung reaksi, gelas ukur, timbangan analitik, autoklaf, Laminar Air Flow (LAF), mikroskop, object glass, cover glass, jarum ose, Bunsen burner, sprayer, wrapper, alumunium foil, pensil, kantong plastik, dan kertas label. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Pengambilan sampel penelitian dilaksanakan di wilayah pertanian rakyat Desa Sumbang Kecamatan Sumbang Kabupaten Banyumas. Pengamatan karakter patogenitas dilaksanakan di Laboratorium Mikologi dan Fitopatologi Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian dilakukan selama 6 bulan yaitu pada bulan Juni sampai dengan Desember 2014. B. Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode survey. pengambilan sampel dilakukan secara Simple random sampling. Sampel diambil dari tiga lokasi, dan setiap lokasi dibagi menjadi 5 petak sampel. B.1. Cara Kerja B.1.1. Isolasi dan Identifikasi Jamur Fusarium 1.1.1. Pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar) (Fardiaz, 1993). 1. Sebanyak 200 g kentang dikupas, dicuci bersih kemudian dipotong dadu kecil-kecil. 2. Potongan kentang direbus dalam 500 ml aquades sampai lunak. 3. Agar-agar 15 g dicampur dengan 250 ml akuades, didihkan kemudian dicampur dengan air rebusan kentang ditambah 20 g dextrose. 8
4. Campuran media ditambah dengan akuades hingga mencapai 1000 ml. 5. Media dimasukkan kedalam tabung Erlenmeyer 250 ml dan tutup dengan kapas. 6. Disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit. 7. Media dituang ke cawan petri steril secara aseptis pada saat akan digunakan. 1.1.2. Pengambilan sampel tanah tanaman cabai merah. Pengambilan sampel dilakukan secara simple random sampling. Pengambilan sampel pada satu lokasi dilakukan secara diagonal dan diperoleh 5 petak dalam satu lokasi. Tanah diambil didekat perakaran tanaman cabai merah. Demikian juga untuk pengambilan sampel pada lokasi 2 dan 3. 1.1.3. Isolasi jamur Fusarium sp. dari sampel rizosfer tanaman cabai merah (Simatupang, 2008). Isolasi jamur dari tanah dilakukan dengan metode pengenceran bertingkat dengan cara sebagai berikut: 1. Tanah sebanyak 10 g dari masing-masing titik dicampur dan dibuat suspensi yaitu mencampurkannya dengan 90 ml air steril. 2. Dikocok selama 15 menit. 3. Suspensi tersebut diambil sebanyak 1 ml. 4. kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml air steril dan dibuat pengenceran berseri sampai pengenceran 10-5. 5. Sampel tersebut diinokulasikan secara spread plate kedalam media PDA dengan wadah cawan petri berdiameter 10 cm dan volume 15 ml yang telah diberi antibiotik kloramfenikol sebanyak 3-5 tetes. 6. Biakan selanjutnya diinkubasi selama tiga hari pada suhu 27 o -29 o C. 1.1.4. Pemurnian jamur Fusarium setelah diisolasi. 1. Diambil miselium semua jamur yang tumbuh dengan jarum ose. 2. Miselium dipindahkan ke cawan yang berisi media PDA baru. 3. Sampel diinkubasi selama 3 hari, perlakuan yang sama diulang hingga mendapatkan biakan murni. 4. Semua jamur yang telah murni kemudian di identifikasi. 9
1.1.5. Identifikasi jamur Fusarium hasil inokulasi dan telah didapatkan biakan murni. Identifikasi dilakukan secara mikroskopis dan makroskopis dengan berpedoman dari sumber pustaka (Barnett and Hunter, 1975) dan (Ganjar, et al., 1999). a). Pengamatan makroskopis - Jamur yang sudah tumbuh pada media PDA dalam cawan petri diamati bentuk koloninya, pertumbuhan koloni, warna koloni dan tepi koloninya. - Hasil dicatat dan difoto. b). Pengamatan mikroskopis - Isolat jamur yang didapat dari hasil pemurnian diambil menggunakan jarum ose, pindahkan ke object glass kemudian tutup dengan cover glass. - Isolat yang berada diatas object glass diletakkan dibawah mikroskop. - Diamati mikrokonidia, makrokonidia dan konidiofor, kemudian dicatat hasilnya dan difoto. B.1.2. Uji sifat patogenik 1.2.1. Pembuatan inokulum Fusarium spp. (Sinaga et. al., 2013 dengan modifikasi). 1. Jagung giling 700 g dicampur dengan dedak sebanyak 290 g. 2. Ditambahkan 10 g CaCO 3 dan akuades secukupnya. 3. Masing-masing 40 g formula medium jagung giling dimasukkan ke dalam botol ukuran 100 ml, kemudian ditutup dengan alumunium foil. 4. Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 100ᵒ-121ᵒC selama 15 menit pada tekanan 2 atm. 5. Diinokulasikan inokulum Fusarium spp. dengan menggunakan jarum ose ke media jagung giling yang dilakukan dalam Laminar air flow (LAF). 6. Diinkubasi dalam ruangan bersih dengan suhu 25ᵒC-27ᵒC selama 7-14 hari. 10
1.2.2. Pembuatan media tanam dan penyemaian cabai merah (Baharuddin, et al., 2005). 1. Tanah yang digunakan sebagai media tumbuh dihancurkan dan diayak terlebih dahulu, selanjutnya tanah disterilkan dalam autoklaf selama 2 jam. 2. Tanah yang sudah steril sebanyak 2,5 Kg dimasukkan kedalam polybag berukuran 25x30 cm. 3. Biji tanaman cabai merah disemai di baki dan dipelihara hingga berumur 30 hari, kemudian dipindahkan ke polybag yang telah disipakan untuk pengujian. 1.2.3. Inokulasi Fusarium sp. ke tanaman cabai merah (Sutrisni & Widodo, 2012). 1. 5 gram inokulum Fusarium spp. dimasukkan ke dalam polybag ukuran 25x30 cm yang berisi tanah steril dan diaduk rata. 2. Diinkubasi selama 5 hari. 3. Cabai merah hasil penyemaian dipindah-tanamkan pada polybag yang sudah diinvestasi dengan isolat Fusarium spp. dan diinkubasi selama 30 hari. 1.2.4. Pengamatan tanaman cabai yang sudah diinokulasi Fusarium sp. (Solichatun, et al., 2013). C. Metode Analisis 1. Pengamatan dilakukan dengan mengamati gejala pada tanaman setelah diinokulasi Fusarium sp. 2. Apabila timbul gejala kelayuan maka diasumsikan sebagai Fusarium sp. patogenik, dan apabila tidak ditemukan gejala kelayuan maka diasumsikan sebagai Fusarium sp. non-patogenik. 3. Pengamatan dilakukan selama 30 hari dengan interval 2 hari. Data hasil pengamatan yang diperoleh dianalisis menggunakan metode analisis deskriptif yang bertujuan untuk mengetahui sifat patogenik dan nonpatogenik jamur Fusarum pada rizosfer tanaman cabai merah di Desa Sumbang, Kecamatan Sumbang, Kabupaten Banyumas. 11
D. Bagan Alir penelitian Persiapan alat dan bahan yang akan digunakan Pembuatan media Potato Dextrose Agar (PDA) Pengambilan sampel tanah pada perakaran tanaman cabai merah Isolasi jamur Fusarium sp. dari sampel tanah dari rizosfer yang telah diambil Identifikasi jamur Fusarium sp. Uji sifat patogenik jamur Fusarium spp. terhadap tanaman cabai Pembuatan inokulum Fusarium spp. Persiapan media tanam untuk tanaman cabai merah (C. annuum), penanaman dan perawatan tanaman cabai merah Inokulasi Fusarium spp. ke media tanam cabai merah satu hari setalah tanam. Pengamatan respon tanaman cabai merah terhadap Fusarium spp. yang diinokulasikan. Gambar 3.1. Diagram alir penelitian 12