23 III. BAHAN DAN METODE 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan Rumah Plastik Pondok Adi Nursery, Desa Cimacan, Kecamatan Pacet, Kabupaten Cianjur, Provinsi Jawa Barat, dari November 2011 hingga Agustus 2012. 3.2. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan meliputi sampel tanah sebagai sumber isolat yang berlokasi di daerah sekitar pembuangan sampah sementara (Dramaga), media Pikovskaya, media Nutrient Agar (NA), Media Potatos Dektrose Agar (PDA), larutan Fisiologis, larutan PB, larutan PC, bibit tanaman krisan (varietas Reagent), pupuk kandang, urea 46% N, SP -36 36% P 2 O 5, dan KCl 60% K 2 O. Alat-alat yang digunakan adalah gelas piala, Erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, coreborer, soil sampler, pinset, pembakar Bunsen, neraca digital (gram) autoklaf, inkubator, kertas saring, cawan petri, alat pengocok (shaker), UV Spektrofotometer, laminair flow air cabinet, ph meter, dan peralatan pengambilan contoh tanah. 3.3. Metode Penelitian 3.3.1. Pengambilan Contoh Tanah Tanah yang berada di lokasi sekitar pembuangan sampah (Dramaga) diambil dari lokasinya. Sampel tanah ini akan digunakan sebagai bahan untuk memperoleh isolat mikroorganisme pelarut fosfat. Pengambilan tanah diambil pada satu titik dengan luasa 1 m 2. Tanah diambil pada kedalaman ± 20 cm dari permukaan tanah secara komposit. 3.3.2. Persiapan Lahan Lahan tanam bunga krisan yang terdapat di Pondok Adi Nursery terdiri atas bedengan-bedengan dalam satu rumah plastik. Jumlah bedengan yang
24 terdapat dalam satu rumah plastik yakni enam sampai delapan bedengan. Setiap bedengan berukuran 20 m x 1.5 m. Jumlah bedengan yang dibutuhkan dalam penelitian ini yakni 3 bedengan. Dua bedengan pertama yang berada dari pinggir area rumah plastik, masing-masing dibuat dua petakan, dimana setiap petakan terdiri atas 6 plot yang menunjukkan jumlah perlakuan dalam penelitian. Sedangkan pada bedengan ketiga dari area rumah plastik, hanya dibuat satu petakan, sehingga jumlah keseluruhan petakan yakni 5 petakan yang menunjukkan jumlah repetisi (ulangan) dalam penelitian. Setiap plot dalam petakan memiliki ukuran 1 m x 1 m, sehingga ukuran luas setiap plot yang berada disetiap petakan adalah 1 m 2. Jarak antara plot yang satu dengan plot yang lain adalah 45 cm. Pada setiap sisi plot ditutupi dengan plastik untuk mencegah longsor pada plot dan mencegah terjadinya kontaminasi antar plot. Persiapan lahan dilakukan dengan membersihkan lahan dari sisa-sisa rumput yang terdapat di permukaan lahan. Selanjutnya dilakukan pengemburan tanah dengan menggunakan cangkul. 3.3.3. Pemupukan Pemupukan terdiri atas 2 kali pemupukan yakni pemberian pupuk dasar dan pupuk susulan. Pupuk dasar diberikan pada saat satu hari sebelum masa tanam bunga krisan. Sedangkan pupuk susulan diberikan setelah masa tanam bunga krisan. Pupuk susulan diberikan sebanyak 3 kali yakni pada 8 MST, 10 MST dan 12 MST. Pupuk dasar meliputi pupuk N, P dan K. Namun, dalam hal ini pupuk P diberikan sesuai dengan perlakuan yang dilakukan dalam penelitian ini. Sedangkan pupuk N dan K diberikan dengan dosis yang sama pada semua perlakuan. Jumlah pupuk hayati yang diberikan pada penelitian ini adalah 50 ml/m 2, sedangkan jumlah pupuk P yang diberikan adalah 60.10 g/m2 untuk dosi penuh dan 30.05 g/m2 untuk 1/2 dosis. Jumlah bakteri pelarut fosfat pada pupuk hayati adalah 1.5 x 10 7 cfu/ml sedangkan jumlah fungi pelarut fosfat pada pupuk hayati adalah 5.0 x 10 7 cfu/ml. Pupuk hayati diberikan dengan cara melakukan penyemprotan pada lahan tanam yang memperoleh perlakuan pupuk hayati menggunakan sprayer ( lampiran ). Pupuk hayati diberikan secara merata pada lahan tanam.
25 Pupuk majemuk NPK, diberikan dengan cara menebarkan pupuk tersebut tepat di atas lahan tanam, supaya merata (homogen) 3.3.4. Isolasi Fungi dan Bakteri Tanah yang berasal dari lokasi sekitar pembuangan sampah pada kedalaman 20 cm, diambil ekstraknya untuk mendapatkan isolat fungi dan bakteri. Sepuluh gram tanah dilarutkan dengan 90 ml larutan fisiologis. Kemudian dikocok dengan alat pengocok (shaker) selama 20 menit. Larutan tersebut kemudian diencerkan sampai diperoleh kepekatan 10-6 untuk fungi dan 10-7 untuk bakteri. Suspensi dari pengenceran untuk fungi yakni 10-4, 10-5, dan 10-6 diambil 1 ml dan dituang ke cawan petri lalu ditambahkan medium pikovskaya steril. Sedangkan untuk bakteri suspensi dari pengenceran 10-4, 10-5, 10-6 dan 10-7, diambil 1 ml dan dituangkan ke cawan petri dan ditambahkan medium pikovskaya cair. Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Koloni bakteri dan fungi yang menunjukkan zona jernih di sekelilingnya diseleksi, kemudian dipindahkan pada cawan agar pikovskaya yang baru dan dinkubasi kembali. Untuk memperoleh fungi yang benar-benar berzona jernih maka secara terus-menerus dilakukan seleksi dengan memindahkan koloni bakteri dan fungi yang tumbuh pada cawan sebelumnya ke cawan agar yang baru. Hasil pemindahan terakhir dipindahkan pada agar miring dan disimpan di lemari pendingin. 3.3.5. Pengujian Kemampuan Bakteri dan Fungi Pelarut Fosfat 3.3.5.1. Uji Kuantitatif Isolat fungi yang diperoleh diuji kemampuannya dalam melarutkan P. Diambil 2 isolat bakteri dan 2 isolat fungi yang memiliki tingkat kemampuan yang tinggi dalam melarutkan P. Isolat-isolat bakteri dan fungi pada agar miring, dipindahkan dan ditumbuhkan pada cawan petri yang berisi pikovskaya padat. Setelah diinkubasi selama 48 jam, dipindahkan ke pikovskaya cair dengan sumber trikalsium fosfat
26 (Ca 3 (PO 4 ) 2 ). Kemudian diinkubasi selama 7 hari. Setelah masa inkubasi berakhir, ditetapkan P-larut dengan UV spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm. Hasil dari pengujian ini dipilih 2 isolat fungi dan 2 isolat bakteri yang baik dan siap dicobakan ke tanaman. 3.3.5.2. Uji Kualitatif Selanjutnya dilakukan penentuan Indeks Pelarutan (IP) dan kecepatan tumbuh dari setiap bakteri dan fungi yang telah terseleksi. yaitu dengan menumbuhkan satu bulatan untuk masing-masing bakteri dan fungi dengan diameter tertentu pada mediua pikovskaya padat. Penentuan Indeks Pelarutan (IP) dan kecepatan tumbuh dilakukan terhadap 6 bakteri dan 6 fungi pelarut fosfat yang berhasil diisolasi. Indeks Pelarutan (IP) ditentukan dengan cara membagi diameter keseluruhan dengan diameter koloni untuk masing-masing bakteri dan fungi pelarut fosfat. Penghitungan diameter dan zona jernih terhadap bakteri dan miselium fungi ini dilakukan tiap hari yang berlangsung selama 5 hari untuk bakteri dan 4 hari untuk fungi. 3.3.5.3. Penghitungan Total Mikroorganisme Pelarut Fosfat Sebanyak 2.5 ml untuk masing-masing biakan bakteri dan fungi yang berada pada media cair pikovskaya setelah inkubasi 4 hari dimasukkan ke dalam larutan 5% molase steril yang memiliki volume 90 ml untuk selanjutnya di inkubasi ± 3 hari. Kemudian dipipet 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan fisiologis secara aseptik dalam serangkaian seri pengenceran sampai 10-8. Kemudian dilakukan penghitungan CFU (Colony forming Unit). Suspensi dari pengenceran 10-4, 10-5, 10-6 dan 10-8 dituangkan pada cawan petri yang berisi media Nutrient Agar (NA) untuk pengujian CFU bakteri dan suspensi dari pengnecran 10-4, 10-5, 10-6 dan 10-8 dipipet 1 ml dan dituangkan ke cawan petri yang berisi media Potatos Dektrose Agar (PDA) untuk penghitungan CFU fungi. Selanjutnya diinkubasi selama ± 48 jam. Penghitungan total mikroorganisme pada pupuk hayati ini dilakukan untuk mengetahui jumlah populasi mikroorganisme pelarut fosfat yang terdapat pada pupuk hayati sebelum diaplikasikan ke lahan tanam.
27 3.3.5.4. Uji Antagonis Isolat-isolat yang telah terpilih yang akan diinokulasikan pada carrier molases dilakukan uji antagonis. Uji antagonis ini dilakuakan untuk mengetahui karakteristik mikroorganisme pelarut fosfat terhadap satu sama lain. Uji ini dilakukan dengan cara menumbuhkan dua isolat bakteri dan dua isolat fungi serta kombinasi antara isolat bakteri dan fungi masing-masing pada satu media Pikovskaya. Selanjutnya dinkubasi selama ± 48 jam. Ilustrasi dan sususnan uji ini dilampirkan pada lampiran. 3.3.6. Penanaman dan Perawatan Krisan Penanaman bunga krisan dilakukan di rumah plastik. Bibit bunga krisan diperoleh dari agen yang menjual bibit bunga krisan. Bunga krisan ditanam di atas bedengan ukuran 1x1 m untuk setiap plot perlakuan. Jarak tanam bunga krisan adalah 12.5x12.5 cm. perawatan meliputi penyiraman bunga krisan, pemberian cahaya lampu pada malam hari, pengendalian hama, dan pembuangan gulma pada lahan tanam krisan, pembuangan daun yang berada pada bagian bawah (1/3 tinggi tanaman dan pembuangan pucuk apikal. 3.3.7. Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok faktor tunggal (pemupukan dengan 6 taraf perlakuan yakni 0 ml pupuk hayati + 0% P, 0 ml pupuk hayati + 50% P, 0 ml pupuk hayati + 100% P, 50 ml pupuk hayati + 0% P, 50 ml pupuk hayati + 50% P, dan 50 ml pupuk hayati + 100% P. Persentase (0%, 50%, 100%) pupuk P yang di berikan berdasarkan pada dosis rekomendasi perkebunan krisan Pondok Adi Nursery, yakni dosis 100% setara dengan 60.10 g/m 2, 50% P setara dengan 30.05 g/m 2, dan 0% P setara dengan 0 g/m 2. Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak lima ulangan. Setiap ulangan berupa satu petak tanam seluas 1 m 2 dengan jumnlah tanaman 80-90 tanaman. Dengan demikian terdapat 30 petak perlakuan dengan total kesekluruhan jumlah tanaman 2400-2700 tanaman. Petak perlakuan ditunjukkan oleh gambar
28 Keterangan : P0D0 : 0 ml pupuk hayati + 0% P P0D1 : 0 ml pupuk hayati + 50% P P0D2 : 0 ml pupuk hayati + 100% P P1D0 : 50 ml pupuk hayati + 0% P P1D1 : 50 ml pupuk hayati + 50% P P1D2 : 50 ml pupuk hayati + 100% P : Ulangan 1-5 1-5 1 m 5 4 1 m 1 2 3 Gambar 4 Petak perlakuan
29 3.3.8. Parameter Pengamatan Parameter dan tata cara pengamatan terhadap bunga krisan mengacu pada Standar Nasional Indonesia (SNI) 01 4478 1998 tentang bunga krisan potong segar. Parameter pengamatan terhadap bunga krisan meliputi tinggi tanaman, diameter tangkai, jumlah daun, warna daun, jumlah bakal bunga, diameter bunga setengah mekar per tangkai, dan jumlah kuntum bunga setengah mekar per tangkai. 3.3.8.1. Tinggi Tanaman Tinggi Tanaman diukur pada dua fase, fase I yaitu pada fase pertumbuhan vegetatif yang dilakukan sebanyak 8 kali, yaitu dari 1 MST hingga 8 MST, fase II adalah fase akhir generatif (Panen). Tinggi tanaman diukur 1 cm dari leher akar hingga sampai titik tumbuh tertinggi pada pucuk batang. Setiap ulangan diamati 5 tanaman contoh untuk pengamatan tinggi vegetatif dan 10 contoh tanaman untuk pengematan tinggi akhir. 3.3.8.2. Diameter Tangkai Diameter tangkai diukur saat setelah panen (15-17 MST) dengan menggunakan jangka sorong ketelitian 0.1 mm. Pengukuran diameter tangkai dilakukan terhadap 5 contoh tanaman hasil panen yang dipilih secara acak pada masing-masing perlakuan 3.3.8.3. Jumlah Daun Jumlah daun dihitung sebanyak 8 kali yaitu dari 1 MST hingga 8 MST yang merupakan fase vegetatif dari pertumbuhan tanaman. Penghitungan jumlah daun dilakukan terhadap 5 tanaman contoh pada setiap perlakuan. 3.3.8.4. Warna Daun Warna daun diamati sebanyak 8 kali yaitu dari 1 MST hingga 8 MST yang merupakan fase pertumbuhan vegetatif tanaman. Warna daun diamati secara visual Kehijauan daun yang diamati selanjutnya disesuaikan dengan kertas color
30 chart yang memiliki gradasi warna hijau meliputi kurang hijau (1), cukup hijau (2), Hijau (3), lebih hijau (4), dan sangat hijau (5). Pengamatan warna daun dilakukan terhadap 5 tanaman contoh pada setiap perlakuan. 3.3.8.5. Jumlah Bakal Bunga Jumlah bakal bunga ditetapkan sebanyak tiga kali yaitu dari 10 MST hingga 12 MST yang merupakan fase generatif dari perkembangan tanaman. Penetapan dilakukan secara visual dengan menghitung jumlah bakal bunga yang mincul. Penghitungan jumlah bakal bunga dilakukan dengan menghitung bakal bunga yang terdapat dari pangkal tanaman hingga pucuk tanaman. Penghitungan jumlah bakal bunga dilakukan terhadap 5 tanaman contoh pada setiap perlakuan. 3.3.8.6. Diameter Bunga Setengah Mekar Per Tangkai Bunga setengah mekar adalah mahkota bunga yang memiliki sudut 45 0 terhadap garis vertikal Jumlah bunga setengah mekar ditetapkan setelah panen dilakukan. Penetapan menggunakan mistar dengan ketelitian 1 mm. Pengukuran diameter bunga setengah mekar dilakukan terhadap 5 contoh tanaman hasil panen yang dipilih secara acak pada masing-masing perlakuan. 3.3.8.7. Jumlah Kuntum Bunga Setengah Mekar Per Tangkai Jumlah kuntum bunga setengah mekar ditetapkan setelah panen dilakukan. Penetapan dilakuaknsecara visual dan menghitung. Penghitungan jumlah bakal bunga dilakukan terhadap 5 contoh tanaman hasil panen yang dipilih secara acak pada masing-masing perlakuan. 3.3.9. Kualitas Bunga Kualitas bunga meliputi pengamatan terhadap bobot basah, tinggi tanaman akhir dan grade bunga, serta jumlah tangkai bunga per tahap panen. Parameter untuk penetapan grade bunga meliputi tinggi tanaman akhir, diameter tangkai bunga, diameter bunga setengah mekar, dan jumlah kuntum bunga setengah mekar.
31 3.3.10. Analisis Data Analisis data dilakukan dengan menggunakan software statistik yaitu SAS (Statistical Analysis Sitem). Analisis sidik ragam dengan metode ANOVA dilakukan untuk menguji pengaruh perlakuan terhadap respon yang diamati. Beda nyata antar perlakuan diuji kembali dengan metode Duncan pada selang kepercayaan 95%.