Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2007 sampai dengan bulan Juli 2008 di Laboratorium Bersama Hewan Percobaan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian dan SEAFAST Center serta di Laboratorium Histologi Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.. Materi Penelitian Penelitian ini menggunakan 25 ekor tikus jantan galur Sprague dawley (Rattus norvegicus) dengan berat badan berkisar antara 150-250 gram. Semua tikus diadaptasikan selama 1 minggu dengan diberi ransum standar sebelum dilakukan penelitian. Tikus-tikus tersebut kemudian dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan, yaitu kelompok kontrol negatif (K-), kelompok kontrol positif (K+), kelompok diabetes yang dicekok VCO A (VA), kelompok diabetes yang dicekok VCO B (VB), serta kelompok diabetes yang dicekok minyak goreng (MG). Metode Penelitian Pembuatan Tikus Diabetes Mellitus Pertama-tama, tikus percobaan diadaptasikan selama 6 hari. Sehari sebelum diinjeksi alloxan tikus-tikus dipuasakan. Hari berikutnya, yaitu setelah dipuasakan tikus-tikus ditimbang berat badannya agar dapat menghitung dosis alloxan yang tepat. Dosis alloxan yang digunakan adalah 110 mg/kg berat badan tikus. Tikus diinjeksi alloxan secara intraperitoneal. Setelah dua hari, tikus diukur glukosa darahnya menggunakan glukometer. Tikus dengan kadar glukosa darah di atas 200 mg/dl dinyatakan menderita diabetes. Persiapan Hewan Coba Penelitian ini menggunakan tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague dawley sebanyak 25 ekor tikus yang dibagi dalam lima kelompok, yaitu: a. Kelompok kontrol negatif (K-) adalah tikus yang tidak diinduksi alloxan; b. Kelompok kontrol positif (K+) adalah tikus diabetes mellitus dan dicekok aquadest;
c. Kelompok VCO A adalah tikus diabetes mellitus yang dicekok dengan VCO A, yaitu VCO yang pembuatannya tanpa panas; d. Kelompok VCO B adalah tikus diabetes mellitus yang dicekok dengan VCO B, yaitu VCO yang pembuatannya dengan panas terkendali; e. Kelompok MG, adalah tikus diabetes mellitus yang dicekok dengan minyak goreng. Dosis aquadest, VCO, dan minyak goreng kelapa yang diberikan 5ml/ekor/hari. Seluruh tikus dalam setiap kelompoknya diberi perlakuan selama 28 hari. Di akhir perlakuan dilakukan pengambilan organ hati. Organ hati difiksasi dengan larutan Bouin selama 24 jam kemudian masuk dalam alkohol 70%. Setelah itu, dipotong-potong dan dimasukkan dalam tissue cassette untuk melewati proses dehidrasi dalam seri alkohol bertingkat yaitu mulai dari alkohol 80% sampai alkohol absolut. Penjernihkan jaringan hati dilakukan dalam xylol lalu di-embedding dalam parafin. Blok jaringan dipotong menggunakan mikrotom (5 µm) dan potongan jaringan dilekatkan pada gelas objek. Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) (Kiernan, 1990) Pewarnaan Hematoxylin Eosin dilakukan untuk mengamati struktur umum jaringan. Tahapan yang dilakukan dalam pewarnaan ini dimulai dengan deparafinisasi, yaitu penghilangan parafin dengan memasukkan preparat ke dalam seri larutan xylol III, II, I. Tahap selanjutnya adalah rehidrasi, yaitu dengan memasukkan preparat ke dalam seri larutan alkohol absolut sampai alkohol 70%. Preparat direndam dalam air keran, kemudian dalam aquadest. Preparat diwarnai dengan pewarna hematoxylin dilanjutkan lagi dengan perendaman dalam aquadest. Setelah itu, preparat diwarnai menggunakan eosin alkohol diikuti perendaman kembali dalam aquadest. Kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat serta penjernihan (clearing) dengan menggunakan xylol. Sediaan ditutup dengan cover glass (mounting).
Pewarnaan Immunohistokimia Pewarnaan immunohistokimia dilakukan untuk mengamati kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada jaringan hati. Langkah awal pewarnaan ini adalah deparafinisasi, rehidrasi, dan preparat direndam dalam distiled water (DW). Langkah selanjutnya adalah preparat dicelupkan dalam larutan 30 ml methanol yang dicampur dengan 0,3 ml H 2 O 2 dalam gelap. Kemudian, preparat direndam kembali dalam DW dan selanjutnya dicuci dengan phosphate buffer saline (PBS). Preparat kemudian diinkubasi dalam normal serum selama 1 jam pada suhu 37 C. Setelah itu, preparat dicuci kembali menggunakan PBS. Lalu preparat diinkubasikan antibodi monoklonal Cu,Zn-SOD (Sigma S2147) pada suhu 4 C selama dua malam. Preparat dicuci sebanyak tiga kali menggunakan PBS dan diinkubasi dalam antibodi sekunder, yaitu Dako Envision Peroxidase System pada suhu 37 C. Selanjutnya, dicuci dengan PBS, visualisasi dilakukan dengan diaminobenzidin (DAB) dalam tris buffer dan H 2 O 2. Untuk perbandingan dengan reaksi negatif, dilakukan counterstain dengan hematoxylin. Langkah akhir pewarnaan ini adalah dehidrasi, clearing, dan mounting. Parameter Hasil pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) pada potongan jaringan hati tikus semua kelompok diamati terhadap morfologi umum sel dan jaringan termasuk kerusakan sel dan jaringan. Pengamatan terhadap potongan jaringan hati yang diwarnai dengan teknik imunohistokimia dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Pengamatan secara kualitatif dilakukan dengan cara melihat intensitas warna jaringan hati yang terwarnai, sedangkan secara kuantitatif dengan menghitung jumlah inti sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD dan menghitung persentase jumlah inti sel hati yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD. Analisis Data Hasil pengamatan terhadap jumlah sel inti sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu, Zn-SOD disusun sebagai Rancangan Acak Lengkap (RAL) dan dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan.
HASIL Morfologi Hati Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) dilakukan untuk mewarnai morfologi sel atau jaringan hati. Hematoxylin bersifat basa akan mewarnai unsur jaringan yang bersifat asam (basofilik), yaitu inti sel. Sedangkan eosin bersifat asam sehingga berfungsi mewarnai sitoplasma yang bersifat basa (asidofilik). Jaringan hati pada kelompok kontrol positif dan kelompok minyak goreng menunjukkan terjadinya kerusakan-kerusakan sel seperti degenerasi dan nekrosa. Terdapat beberapa sel dengan inti dan sitoplasma yang membesar dan berwarna lebih pucat. Nekrosa sel hati ditandai dengan inti sel yang pecah. Pada kelompok perlakuan VCO A dan VCO B ditemukan degenerasi dan nekrosa namun tidak sebanyak yang tampak pada kelompok kontrol positif maupun kelompok perlakuan minyak goreng. Pada kelompok kontrol negatif ditemukan degenerasi dan nekrosa pada beberapa bagian sel tetapi masih dalam batas yang normal karena di dalam jaringan yang normal pasti terdapat beberapa sel yang mengalami degenerasi dan nekrosa (Gambar 1). Profil Cu, Zn-SOD Pewarnaan imunohistokimia dilakukan dengan tujuan untuk mendeteksi kandungan atau komponen aktif yang ada dalam jaringan atau sel yang melibatkan penggunaan antibodi. Prinsip dasar pewarnaan ini adalah adanya ikatan antara antigen dan antibodi. Pewarnaan imunohistokimia pada penelitian ini dilakukan untuk melihat adanya kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus kelompok kontrol, kelompok diabetes, dan kelompok perlakuan (VA, VB, dan MG). Pengamatan secara kualitatif dilakukan pada jaringan hati dengan cara mengamati intensitas warna yang terjadi. Semakin tua warna coklat pada jaringan hati, semakin tinggi kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tersebut. Pada kelompok diabetes (K+) dan kelompok minyak goreng (MG) kandungan Cu,Zn- SOD pada jaringan hati lebih rendah dibandingkan dengan kontrol negatif (K-). Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD kelompok VA lebih tinggi dibanding
kelompok K+, namun kandungan Cu,Zn-SOD kelompok VA masih lebih rendah dibanding kelompok K-. Pada kelompok VB, kandungan Cu,Zn-SOD lebih tinggi dibanding kelompok K+, namun kandungan Cu,Zn-SOD pada kelompok VB lebih rendah dibanding kelompok VA (Gambar 2). Pengamatan kuantitatif kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati dilakukan dengan menghitung jumlah inti sel hati yang bereaksi pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD. Reaksi tersebut dapat terlihat dengan adanya perbedaan intensitas warna pada inti sel hati, antara lain warna untuk reaksi positif, yaitu positif kuat yang ditunjukkan dengan warna coklat tua (+++), positif sedang yang ditunjukkan dengan warna coklat muda (++), positif lemah yang ditunjukkan dengan warna coklat sangat muda (+) dan untuk reaksi negatif ditunjukkan dengan warna biru (-). Hasil penghitungan jumlah inti sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Rata-rata jumlah inti sel hati yang bereaksi pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus perlakuan perlapang pandang pada pembesaran 40x Jumlah Inti Sel Hati Kelompok +++ ++ + - K- 71.7± 5.5 e 47.5 ± 5.9 d 26.1 ± 4.7 a 27.9 ± 5.6 b K+ 30.2 ±14.1 b 35.2 ± 12.3 b 55.9 ± 8.6 d 57.1 ± 10.0 c VA 48.6 ± 6.6 d 44.3 ± 7.9 cd 29.3 ± 4.0 a 20.5 ± 5.2 a VB 38.1 ± 4.0 c 41.1 ± 4.7 c 35.3 ± 2.8 b 28.3 ± 3.6 b MG 21.5 ± 2.6 a 29.3 ± 3.4 a 44.5 ± 3.2 c 57.9 ± 15.2 c Keterangan : Superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan nilai yang berbeda nyata (p<0.05)
Gambar 1. Fotomikrograf jaringan hati tikus perlakuan K-: kontrol negatif, K+: kontrol positif, VA: diabetes + VCO A, VB: diabetes + VCO B, MG: diabetes + minyak goreng. Pewarnaan Hematoxylin Eosin skala 5µm.
Gambar 2. Fotomikrograf jaringan hati tikus perlakuan K-: kontrol negatif, K+: kontrol positif, VA: diabetes + VCO A, VB: diabetes + VCO B, MG: diabetes + minyak goreng. Pewarnaan imunohistokimia Cu,Zn-SOD skala 5µm.
Hasil uji statistik terhadap jumlah inti sel hati terhadap berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD menunjukkan kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati pada kelompok K+ lebih rendah dibanding kelompok K-. Hal ini terlihat pada jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat dan positif sedang lebih rendah secara nyata (p<0.05) pada kelompok diabetes (K+) dibanding kelompok kontrol negatif. Rendahnya kandungan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari jumlah inti sel hati yang bereaksi negatif lebih tinggi secara nyata (p<0.05) pada kelompok diabetes (K+) dibanding kelompok kontrol negatif (K-). Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok VA dan VB lebih tinggi dibanding kelompok K+. Pada kelompok VA, jumlah inti sel yang memberikan reaksi positif kuat dan positif sedang lebih tinggi secara nyata (p<0.05) dibanding kelompok K+. Hal ini juga terlihat dari jumlah inti sel yang bereaksi negatif lebih rendah secara nyata (p<0.05) pada kelompok VA dibanding kelompok K+. Begitu juga pada kelompok VB, kandungan Cu,Zn-SOD kelompok VB lebih tinggi dibanding kelompok K+. Hal ini terlihat dari jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat dan positif sedang lebih tinggi secara nyata (p<0.05) pada kelompok VB. Tingginya kandungan Cu,Zn-SOD pada kelompok VB juga dilihat dari jumlah inti sel yang bereaksi negatif lebih rendah secara nyata (p<0.05) dibanding kelompok K+. Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok MG lebih rendah dibanding kelompok K-. Jumlah inti sel yang memberikan reaksi positif kuat dan positif sedang pada MG lebih rendah secara nyata (p<0.05) dibanding kelompok K-. Rendahnya kandungan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari jumlah inti sel bereaksi negatif pada MG lebih tinggi secara nyata (p<0.05) dibandingkan kelompok K-. Untuk melihat profil kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada hati tikus dilakukan dengan perhitungan persentase jumlah inti sel hati yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD (Gambar 3).
% JUMLAH 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 K K+ VA VB MG KELOMPOK + Gambar 3. Persentase jumlah inti sel hati yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD. + : Positif; - : Negatif. Hasil persentase jumlah inti sel hati yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD menunjukkan kandungan Cu,Zn-SOD lebih rendah pada kelompok K+ dan MG dibandingkan dengan kelompok K-. Hal ini terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi positif lebih rendah pada kelompok K+ (67,9%) dan MG (62,1%) dibanding kelompok K- (83,9%). Rendahnya kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi negatif lebih tinggi pada kelompok K+ (32%) dan MG (37,8%) dibanding kelompok K- (16%). Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok VA lebih tinggi dibanding kelompok K+. Hal ini terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi positif lebih tinggi pada kelompok VA (85,6%) dibanding kelompok K+ (67,9%). Tingginya kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi negatif lebih rendah pada kelompok VA (14,4%) dibanding kelompok K+ (32%). Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD kelompok VB lebih tinggi dibanding kelompok K+. Hal ini dapat dilihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi positif lebih tinggi pada kelompok VB (80,2%) dibanding kelompok K+ (67,9%). Tingginya kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi negatif lebih rendah pada kelompok VB (19,8%) dibanding kelompok K+ (32%). Jika kelompok VA dan kelompok VB dibandingkan, kandungan antioksidan Cu,Zn- SOD kelompok VA lebih tinggi dibanding kelompok VB. Hal ini terlihat dari persentase jumlah inti sel hati pada reaksi positif lebih tinggi pada kelompok VA
(85,6%) dibanding kelompok VB (80,2%). Tingginya kandungan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari persentase jumlah inti sel hati yang memberikan reaksi negatif lebih rendah pada kelompok VA (14,4%) dibanding kelompok VB (19,8%).