BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada tanggal 30 April 2013 hingga 9 Mei 2013 dan terbagi menjadi dua tahap. Tahap pertama merupakan penelitian pendahuluan sedangkan untuk tahap kedua merupakan penelitian utama. Lokasi penelitian utama adalah di Laboratorium Manajemen Sumberdaya Perairan, FPIK UNPAD dan lokasi untuk ekstraksi etanol bayam adalah di Laboratorium Bahan Alam, Farmasi UNPAD. 3.2 Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1 Alat yang Digunakan Adapun peralatan yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 4, Tabel 5, Tabel 6 dan Lampiran 2: Tabel 4. Peralatan yang Digunakan Dalam Kultur Chlorella sp. No. Nama Alat Jumlah Fungsi Alat 1. Toples volume 2,5 liter 15 Wadah untuk penelitian 2. Lampu neon (4000 lux) 2 Alat tambahan dalam kultur Chlorella 3. Aerator, batu aerasi dan selang aerasi 15 Penunjang ketersediaan DO 4. ph meter (ketelitian 0,1) 1 Pengukur ph 5. Termometer air raksa (ketelitian 0,1 0 C) 1 Pengukur suhu media uji 6. DO meter 1 Pengukur oksigen terlarut 7. Mikroskop cahaya merk Olympus 1 Menghitung kelimpahan sel Chlorella 8. Haemocytometer Neubauer Improved 1 Media perhitungan kelimpahan sel Chlorella 9. Hand counter 1 Menghitung kelimpahan sel Chlorella 10. Gelas ukur 1 Media untuk mengukur volume aquades 11. Cover glass 1 Media penutup untuk Haemocytometer 12. Pipet 1 Alat untuk memindahkan biakan Chlorella 21
22 Tabel 5. Peralatan yang Digunakan Dalam Pembuatan EEB. No. Nama Alat Jumlah Fungsi Alat 1. Timbangan digitial (ketelitian 0,1 g) 1 unit Menimbang bahan baku bayam 2. Timbangan analitik (ketelitian 0,0001 g) 1 unit Menimbang EEB dan pupuk anorganik 3. Oven 1 unit Mengeringkan sampel bayam 4. Mortar dan cawan mortar 1 unit Menggerus bayam menjadi simplisia 5. Ayakan ukuran 4/18 1 unit Menyaring simplisia bayam kasar 6. Destilator 1 unit Pemurnian pelarut etanol 70% 7. Maserator 1 unit Alat penyaring larutan simplisia bayam 8. Beaker glass Iwaki 500 ml 1 unit Menampung supernatan simplisia 9. Rotary Vacuum Evaporator 1 unit Alat pemisah pelarut dan supernatan 10. Tabung reaksi 4 unit Media uji fitokimia Tabel 6. Peralatan yang Digunakan Dalam Analisis Klorofil-a. No. Nama Alat Jumlah Fungsi Alat 1. Kertas saring dan corong 15 unit Menyaring sampel Chlorella 2. Gelas ukur 10 ml 1 unit Mengukur aseton 90% 3. Sentrifugator 1 unit Memisahkan supernatan dengan natan 4. Cuvet 1 unit Wadah dalam pemeriksaan klorofil-a 5. Spektrophotometer 1 unit Pengukur kandungan klorofil-a
23 3.2.2 Bahan yang Digunakan Adapun bahan yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 7, Tabel 8, Tabel 9 dan Lampiran 3 : Tabel 7. Bahan yang Digunakan Dalam Kultur Chlorella sp. No. Nama Bahan Jumlah Fungsi Bahan 1. Biakan Chlorella sp. murni 1 liter Biakan dalam penelitian 2. Pupuk ZA, pupuk urea dan pupuk TSP 3 gram Pupuk kontrol dalam penelitian 3. Estrak etanol bayam 390 mg Pupuk uji dalam penelitian 4. Aquades 15 liter Media penelitian dan sterilisasi peralatan 5. KOH 1% dan HCl 1% 20 ml Pengaturan ph pada media penelitian 6. Kaporit 2 unit Sterilisasi selang aerator dan toples 7. Alkohol 70% 50 ml Sterilisasi peralatan 8. Aseton 50 ml Sterilisasi peralatan Tabel 8. Bahan yang Digunakan Dalam Pembuatan EEB No. Nama Bahan Jumlah Fungsi Bahan 1. Etanol 70% 1 liter Bahan pelarut untuk ekstraksi bayam 2. Bayam segar 100 gram Bahan utama dalam penelitian 3. Asam sulfat 2N dan pereaksi meyer 2 ml Uji alkaloid 4. Kloroform dan anhidrida asetat 2 ml Uji Steroid 5. Serbuk magnesium dan amil alkohol 2 ml Uji Flavonoid 6. HCl 2N 2 ml Uji Saponin 7. Alumunium foil 5 unit Penutup sampel ekstrak etanol bayam Tabel 9. Bahan yang Digunakan Dalam Analisis Klorofil-a No. Nama Bahan Jumlah Fungsi Bahan 1. Sampel biakan Chlorella 600 ml Bahan uji klorofil-a 2. Aseton 90% 10 ml Bahan pelarut klorofil-a dari sampel
24 3.3 Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimen yang dilaksanakan di laboratorium. Rancangan eksperimental yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RA L) dengan lima taraf perlakuan masing-masing diulang sebanyak tiga kali. Dengan keterangan sebagai berikut : Perlakuan Kontrol* : Pemberian pupuk ZA sebesar 40 mg/l, Urea sebesar 80 mg/l dan TSP sebesar 15 mg/l + biakan Chlorella sebanyak 9,5 ml. Perlakuan A : Pemberian ekstrak etanol bayam sebesar 2 mg/l + biakan Chlorella sebanyak 9,5 ml. Perlakuan B : Pemberian ekstrak etanol bayam sebesar 5 mg/l + biakan Chlorella sebanyak 9,5 ml. Perlakuan C : Pemberian ekstrak etanol bayam sebesar 8 mg/l + biakan Chlorella sebanyak 9,5 ml. Perlakuan D : Pemberian ekstrak etanol bayam sebesar 11 mg/l + biakan Chlorella sebanyak 9,5 ml. Keterangan * = Sesuai literatur Jusadi (2003). 3.3.1 Tahap Penelitian Adapun tahapan-tahapan atau alur proses dalam penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 4.
25 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Sterilisasi Alat dan Media Kultur Semua peralatan non elektronik dicuci dengan menggunakan sabun pencuci perabotan gelas, kemudian dibilas dengan air dingin yang telah dimasak pada suhu 100 0 C. Selanjutnya peralatan tersebut dibilas dengan larutan aseton, kemudian dibilas kembali dengan air dingin hasil rebusan. Pembilasan selanjutnya adalah menggunakan alkohol 70% dan terakhir dibilas dengan akuades hingga bau alkohol hilang. Pengeringan peralatan setelah pencucian dilakukan dengan meniriskannya di atas meja yang telah disemprot alkohol sebelumnya. Selang plastik aerator dan toples disterilkan terlebih dahulu dengan merendamnya dalam larutan kaporit selama 10-15 menit. Pencucian dilakukan dengan air dingin hasil rebusan dan ditiriskan hingga kering seperti langkah pencucian peralatan. 3.4.2 Persiapan Ekstraksi Etanol Bayam Ekstraksi etanol bayam dilakukan dengan metode maserasi. Metode ini dilakukan dengan cara sebagai berikut : Bayam dikeringkan dalam oven pada suhu 60-80 0 C hingga kering. Kemudian digiling menggunakan mortar menjadi serbuk, lalu diayak dengan menggunakan ayakan ukuran 4/18. Selanjutnya serbuk bayam (simplisia) sebanyak 100 g dimasukkan ke dalam maserator, setelah itu ditambahkan pelarut etanol 70% sebanyak 400 ml (dengan perbandingan 1:4). Sebelum pelarut etanol 70% digunakan, pelarut dimurnikan terlebih dahulu menggunakan alat destilator sesuai dengan titik didih pelarut etanol 70% (titik didih =79-80 0 C). Kemudian direndam selama 24 jam dan dilakukan pengadukan secara random sebanyak 3 kali. Setelah itu dilakukan penampungan filtrat. Ampas yang didapatkan dari hasil penyaringan kemudian direndam kembali dengan menggunakan etanol 70% (Mursity 2004). Prosedur ini dilakukan sebanyak 3 kali. Setelah filtrat didapatkan maka dilakukan evaporasi dengan menggunakan rotary vacum evaporator hingga dihasilkan ekstrak semi padat etanol bayam. Pembuatan masing-masing konsentrasi ekstrak etanol bayam dengan cara perlakuan ditimbang dengan timbangan analitik dengan ketelitian 0,0001 g untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak etanol bayam yang diinginkan. Ekstrak etanol
26 bayam yang telah ditimbang kemudian dilarutkan secara bertahap dalam aquades menggunakan bantuan mortar hingga mencapai 2/3 dari volume total kultur Chlorella sp. yang akan dibuat. 3.4.3 Perhitungan Kepadatan Sel Chlorella sp. Untuk memudahkan penghitungan fitoplankton yang diamati biasanya menggunakan alat bantu hand counter dan Haemocytometer. Cara penghitungan kepadatan dari Chlorella sp. dengan Haemocytometer (Gambar 7) adalah sebagai berikut: Haemocytometer dibersihkan dan dikeringkan terlebih dahulu dengan tissue. Kemudian cover glass dipasang pada Haemocytometer. Chlorella Gambar 7. Haemacytometer (Sumber : Isnansetyo 1995) sp. yang akan dihitung kepadatannya diteteskan dengan menggunakan pipet tetes pada bagian parit yang melintang hingga penuh. Penetesan dilakukan secara hati-hati agar tidak terjadi gelembung udara dibawah gelas penutup. Selanjutnya Haemocytometer tersebut diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 kali dan dicari bidang yang berkotak-kotak. Untuk mengetahui kepadatan Chlorella dengan cara menghitung Chlorella yang terdapat pada kotak bujur sangkar yang mempunyai sisi 1 mm. Untuk menghitung jumlah sel Chlorella sp. dapat menggunakan alat bantu hand counter. Nilai kepadatan Chlorella dapat dihitung pada beberapa bagian chamber (perhitungan pada chamber kecil) bila kepadatannya relatif sangat tinggi, maka penghitungan hanya dilakukan pada beberapa chamber saja (umumnya 80
27 chamber). Untuk pengambilan data kepadatan sel Chlorella dengan kepadatan relatif tinggi biasanya hanya menggunakan 80 chamber kecil. Dengan demikian, kepadatan sel Chlorella dapat dihitung dengan menggunakan rumus kelimpahan sel menurut Isnansetyo (1995) sebagai berikut : Luas chamber kecil = panjang x lebar = 0,05 mm x 0,05 mm = 0,0025 mm 2 Volume chamber kecil= luas x kedalaman = 0,0025 mm 2 x 0,1 mm = 0,00025 mm 3 Karena 1 ml = 1 cm 3, maka : = 0,00025 mm 3 = 0,00000025 cm 3 = 25 x 10-8 ml Sehingga, rumus menghitung jumlah sel/ml dalam chamber kecil (80 kotak) : = rata-rata jumlah sel (dari 80 kotak) / 25 x 10-8 ml = rata-rata jumlah sel (dari 80 kotak) x ( 1 / 25 ) x 10 8 = rata-rata jumlah sel (dari 80 kotak) x 4 x 10 6 Nilai kepadatan Chlorella dapat dihitung pada chamber sedang bila kepadatannya relatif rendah. Jumlah pengambilan data jika kepadatan Chlorella relatif rendah, biasanya hanya menggunakan 5 chamber ukuran sedang. Dengan demikian, kepadatan sel Chlorella dapat dihitung dengan menggunakan rumus kelimpahan sel menurut Isnansetyo (1995) sebagai berikut (Lampiran 5): Rata-rata jumlah sel (dari 5 kotak) x 25 x 10 4 /ml =... sel
28 Laju perkembangbiakan spesifik ( μ) (Lampiran 6) fitoplankton dihitung dengan formula menurut Krichnavaruk et al. (2004) sebagai berikut : ln N T t t ln N T 0 0 Dengan : N t N 0 T 0 T t = Laju perkembangbiakan spesifik. = Kepadatan populasi sel pada waktu ke-t. = Kepadatan populasi sel pada waktu ke-0. = Waktu awal. = Waktu pengamatan. Perhitungan waktu lag phase (Lampiran 7) adalah dengan cara mengitung regresi linear selama fase eksponensial (Suminto dan Hirayama 1996), dengan rumus : Y = Ak +B Dengan : Y = Logaritma kepadatan sel pada hari ke-0. B dan k= Hasil perhitungan regresi linear selama fase eksponensial A = Estimasi waktu lag phase 3.4.4 Inokulasi Biakan Chlorella sp. Biakan awal Chlorella sp. yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari laboratorium Manajemen Sumberdaya Perairan. Biakan Chlorella sp. kemudian diaklimatisasi terhadap suhu ruangan kultur selama 1 hari dengan menambahkan udara melalui aerator. Biakan Chlorella yang dipakai dalam penelitian ini yakni Chlorella air tawar. Inokulasi biakan Chlorella sp. dilakukan setelah menghitung kepadatan stok dengan cara mengambil sampel Chlorella sp.
29 dari media stok dan kemudian dihitung dibawah mikroskop dengan haemocytometer. Untuk menentukan volume biakan yang ditambahkan dapat digunakan rumus sebagai berikut : V 1.N 1 = V 2.N 2 Dengan : V 1 N 1 V 2 N 2 = Volume biakan yang diinokulasikan. = Kepadatan stok. = Volume media kultur. = Kepadatan yang dibutuhkan. 3.4.5 Pengaturan Nilai ph Pada Media Kultur Setelah adanya penambahan ekstrak etanol bayam pada media aquades, kemudian dilakukan pengaturan ph. Pengaturan ph dilakukan dengan cara menambahkan HCl 1% ataupun KOH 1% ke dalam setiap lima media perlakuan hingga media ekstrak etanol bayam memiliki nilai rentang ph sebesar 7 (Basmi et al. 2003). 3.4.6 Uji Fitokimia Sampel yang diambil untuk uji fitokimia adalah simplisia bayam. Uji fitokimia bertujuan untuk menentukan komponen bioaktif yang terkandung dalam suatu bahan, dapat dilihat pada Lampiran 8. Identifikasi kandungan bioaktif dari ekstrak etanol bayam adalah uji alkaloid, uji steroid, uji flavonoid dan uji saponin (Harbonne 1987). a.) Uji Alkaloid Sejumlah sampel simplisia (serbuk bayam) dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2N, kemudian diuji dengan pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Meyer. Adapun prosedur dalam pembuatan pereaksi Meyer (Lampiran 9). Hasil uji sampel dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer membentuk endapan putih kekuningan.
30 b.) Uji Steroid Sebanyak 0,5 gram simplisia dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhidrida asetat sebanyak 10 tetes dilanjutkan dengan asam sulfat pekat sebanyak 3 tetes, ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif sampel mengandung steroid yaitu terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau. c.) Uji Flavonoid Sebanyak 0,05 gram sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol 70%, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid yaitu terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. d.) Uji Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2N menunjukan sampel mengandung saponin. 3.4.7 Pengukuran Nilai Klorofil-a Sampel Chlorella disaring dengan menggunakan corong dan kertas saring sebanyak 3 lapis, penyaringan dilakukan hingga sampel berwarna bening, selanjutnya memindahkan Chlorella yang tersaring dalam kertas saring ke dalam cawan mortar dengan menggunakan sendok spatula, kemudian Chlorella hasil penyaringan sebelumnya digerus dengan menggunakan mortar sampai halus. Tahap selanjutnya yakni mengencerkan hasil penggerusan Chlorella sebelumnya menggunakan aceton 90% sebanyak 10 ml. Hasil pengenceran Chlorella dipindahkan kedalam cuvet untuk disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan putaran sebesar 300 rpm. Tahap akhir yakni, menganalisis kandungan klorofil-a Chlorella menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang 750 nm, 665 nm dan 645 nm.
31 Perhitungan nilai konsentrasi klorofil-a (Lampiran 10) diacu berdasarkan rumus Vollenweider (1974) sebagai berikut : Ca V vxl Dengan : Ca V v L D750 D665 D645 = (11,6. D750) (1,31. D665) (0,14. D645). = Volume aseton yang digunakan (10 ml). = Volume air yang tersaring untuk direaksi. = Panjang Cuvet (3cm). = Optikal density pada panjang gelombang 750 nm. = Optikal density pada panjang gelombang 665 nm. = Optikal density pada panjang gelombang 645 nm. 3.5 Parameter Yang Diamati Parameter-parameter yang diamati selama penelitian ini antara lain sebagai berikut: Respon Chlorella sp. terhadap pemberian ekstak etanol bayam pada penelitian pendahuluan. Kelimpahan sel Chlorella sp. (sel/ml) setiap hari pada masing -masing perlakuan pada penelitian utama. Parameter fisik seperti suhu pada media kultur ( 0 C), parameter kimiawi seperti ph pada media kultur, DO pada media kultur (mg/l) dan parameter biologis seperti klorofil-a.
32 Adapun keterangan dari pengamatan parameter fisik, kimiawi dan biologis disajikan pada Tabel 10. Tabel 10. Parameter Fisik, Kimiawi dan Biologi Parameter Satuan Alat Yang Digunakan Keterangan Suhu 0 C Termometer air raksa Pengukuran dilakukan setiap hari ph - ph meter Pengukuran dilakukan setiap hari DO Klorofil-a mg/l mg/l DO meter Spektophotometer Pengukuran dilakukan setiap hari Pengukuran dilakukan pada akhir penelitian 3.6 Analisis Data Analisis terhadap data penelitian dilakukan dengan dua metode, yaitu analisis statistik dan analisis korelasi dengan menggunakan program statistik, yakni program SPSS versi 18. Analisis statistik dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol bayam terhadap kultur Chlorella dan analisis korelasi berfungsi untuk mengetahui interaksi paramater-parameter kimiawi dengan parameter biologis yang diukur. Analisis statistik yang dilakukan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) atau Complete Random Design untuk mengetahui pengaruh pemberian variasi konsentrasi ekstrak etanol bayam terhadap perkembangbiakan Chlorella sp. Uji statistik dilakukan dengan uji Anova (Analysis of Variance) satu faktor. Model matematis dari analisis rancangan acak lengkap (RAL) adalah sebagai berikut: Y ij = μ + T i + Ԑ ij Dengan : Y ij μ T i Ԑ ij = Pengamatan kelompok ke-i dan perlakuan ke-j. = Rataan umum. = Pengaruh perlakuan ke-i. = Galat pada percobaan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j.
33 Hipotesis yang diuji dalam analisis statistik ini adalah hipotesis tentang pengaruh konsentrasi ekstrak etanol bayam. Hipotesis pengaruh ekstrak etanol bayam terhadap perkembangbiakan kultur Chlorella sp. adalah sebagai berikut: H 0 =Konsentrasi EEB yang diberikan tidak berpengaruh terhadap perkembangbiakan Chorella sp. H 1 = Konsentrasi EEB berpengaruh terhadap perkembangbiakan Chlorella sp. Penentuan relatifitas pengaruh pemberian konsentrasi ekstrak etanol bayam optimal terhadap perkembangbiakan Chlorella sp. dilakukan dengan menggunakan Uji Duncan ( Duncan Test) dengan taraf 5% (Gaspertz 1991), dengan rumus sebagai berikut : Dimana: p = Banyaknya perlakuan. R = Tergantung dari banyaknya perlakuan yang dibandingkan.