III. METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan, mulai bulan Maret 2011 sampai dengan Agustus 2011. Berlokasi di Laboratorium Jasa Analisis Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Kampus IPB Darmaga P.O. Box 220, Bogor 16002. Telp. (0251) 8629855 Faks. (0251) 628855. 3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah telur ayam broiler (Gallus sp.) yang diperoleh dari pasar lokal di sekitar Bogor. Pereaksi yang digunakan adalah metanol, KOH, heksan, gas N 2 teknis, gas N 2 HP (high purity), HCl, 2 propanol (isopropanol), standar kolesterol kemurnian 95% (Sigma Chemical Inc, USA), aqua demineralisasi, Na 2 SO 4 anhidrous, dan kertas saring. Alat yang digunakan pada penelitian ini mencakup neraca analitik (Kern & Sohn, Jerman), vortex, waterbath, HPLC LC 6A (Shimadzu, Jepang), kolom normal phase LiChrosorb Si 60 (10µm) (25 cm x i.d. 4,6 cm) (Merck, Jerman), detektor ELSD Sedex 55 (Sedere, Prancis). Alat gelas yang digunakan seperti tabung reaksi bertutup, labu pemisah, pipet tetes, corong gelas, erlenmeyer, baker glass, sudip, pipet volumetrik, pipet mikro (Biohit Proline), pipet Mohr, syringe dan pipet tetes. 3.3. Metode Penelitian Metode penelitian yang dilakukan meliputi uji kesesuaian sistem, spesifisitas, pengukuran linieritas metode, limit deteksi instrumen (IDL), ketepatan (akurasi), ketelitian (presisi), method detection limit (MDL), dan intra reprodusibilitas. 3.3.1. Pemilihan dan preparasi sampel Sampel yang dipergunakan adalah telur ayam broiler (Gallus sp.). Sampel ini diperoleh pasar disekitar kota Bogor. Jumlah sampel yang dibeli adalah satu kotak (10 butir). Preparasi sampel diawali dengan pencampuran 10 butir telur dalam sebuah wadah, kemudian dikocok hingga tercampur rata. Sampel yang telah tercampur rata kemudian di masukkan kedalam 15 kantung plastik kecil dan disimpan dalam lemari pembeku dengan suhu - 18ºC. 3.3.2. Uji kesesuaian sistem Uji kesesuaian sistem dilakukan dengan cara menyuntikkan salah satu larutan standar kolesterol sebanyak 7 kali ulangan, kemudian dihitung nilai SD dan RSD-nya dari waktu retensi dan luas area peak yang dihasilkan. Dengan batas RSD 2,00%. 14
3.3.3. Spesifisitas Uji spesifisitas dilakukan dengan membandingkan waktu retensi antara standar kolesterol, sampel telur dan sampel telur yang diberi tambahan standar kolesterol. 3.3.4. Linieritas metode Linieritas dilakukan dengan menginjeksikan larutan sample standar kolesterol enam konsentrasi yang berbeda (300 µg/ml, 750 µg/ml, 1500 µg/ml, 3000 µg/ml, 7500 µg/ml, dan 15000 µg/ml) yang ditambahkan kedalam maktriks sampel sebanyak 3 g. Dilakukan tiga kali ulangan pada masing-masing konsentrasi kolesterol standar. Kemudian menghitung nilai standar deviasi dan RSD. Linieritas diukur dengan nilai R 2 dari kurva hubungan antara luas area peak standar (sebagai sumbu y) dengan konsentrasinya (mg/g) (sebagai sumbu x). Linieritas yang baik adalah R 2 lebih dari 0,99. 3.3.5. Limit Deteksi Instrumen (LDI) Limit Deteksi Instrumen (LDI) ditentukan dengan cara menyuntikkan standar kolesterol. Dilakukan dengan tujuh kali injeksi larutan standar dengan konsentrasi terendah yang dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD. Standar deviasi dari tujuh penentuan tersebut dihitung, kemudian nilai LDI ditentukan sebagai berikut: = rata-rata kadar sampel LDI = Limit Deteksi Instrumen SD Hasil dari pengujian SD pada uji LDI digunakan untuk menguji LOQ dengan menggunakan rumus sebagai berikut: LOQ hitung = Limit of Quantitation SD 15
3.3.6. Akurasi dan Presisi Akurasi dilakukan dengan menguji rekoveri. Uji ini dilakukan dengan menggunakan sampel spike pada tiga konsentrasi kolesterol berbeda dari matriks sampel. Konsentrasi spiking yang dicobakan adalah konsentrasi rendah (sama dengan konsentrasi LOQ hitung ), konsentrasi sedang (lima kali konsentrasi LOQ hitung ), dan konsentrasi tinggi (konsentrasi kolesterol tertinggi dalam matriks). Percobaan spiking dilakukan sebanyak tujuh kali ulangan. Kemudian dihitung hasil rekoveri standar dengan menggunakan rumus berikut: Presisi dilakukan dengan mengukur ripitabilitas. Uji ini dilakukan dengan menggunakan sampel spike pada tiga konsentrasi kolesterol berbeda dari matriks sampel. Konsentrasi spiking yang dicoba adalah konsentrasi rendah (sama dengan konsentrasi LOQ hitung ), konsentrasi sedang (lima kali konsentrasi LOQ hitung ), dan konsentrasi tinggi (konsentrasi kolesterol tertinggi dalam matriks). Percobaan spiking dilakukan sebanyak tujuh kali ulangan. Kemudian dihitung nilai SD dan RSD-nya sebagai berikut: = rata-rata kadar reserpin 3.3.7. Method Detection Limit (MDL) Method Detection Limit (MDL) ditentukan dengan menginjeksikan 3 konsetrasi spiking standar kolesterol yang berbeda. Konsentrasi spiking yang dicobakan adalah konsentrasi rendah (sama dengan konsentrasi LOQ hitung ), konsentrasi sedang (lima kali konsentrasi LOQ hitung ), dan konsentrasi tinggi (konsentrasi kolesterol tertinggi dalam matriks). Masing-masing konsentrasi diinjeksikan sebanyak 7 kali ulangan, kemudian dihitung standar deviasi per konsentrasi yang ditambahkan. Dari 3 nilai standar deviasi tersebut, kemudian diplotkan kedalam kurva hubungan antara konsentrasi standar (sumbu x) yang ditambahkan dengan standar deviasinya (sumbu y). Nilai interpolasi pada x sama dengan nol sebagai SD 0. Nilai MDL dihitung sebagai 3 kali nilai SD 0. 3.3.8. Intra Reprodusibilitas Reprodusibilitas (menggunakan satu operator, satu laboratorium pada jangka waktu yang pendek namun berbeda hari) dilakukan dengan menggunakan satu sampel matriks dan dilakukan tiga kali ulangan untuk setiap matriks di hari yang sama. Kemudian dihitung nilai standar deviasinya dan RSD dengan menggunakan rumus berikut: 16
= rata-rata kadar reserpin 3.4. Prosedur Analisis Kolesterol Prosedur analisis yang dilakukan diawali dengan melakukan persiapan larutan standar kolesterol, persiapan sampel pada matriks telur dan analisis menggunakan HPLC-ELSD. 3.4.1. Persiapan larutan standar kolesterol: Larutkan 50 mg standar kolesterol powder dalam 50 ml fase gerak (heksan:isopropanol = 90:10) dan larutan 150 mg standar kolesterol powder dalam 50 ml fase gerak. Larutan standar stok ini mempunyai konsentrasi 1000 µg/ml dan 15000 µg/ml. Dilanjutkan dengan pengenceran larutan stok untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 10 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml, 250 µg/ml, 300 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1500 µg/ml, 3000 µg/ml, dan 7500 µg/ml. 3.4.2. Persiapan sampel pada matriks telur (AOAC 976.26.): Timbang sekitar 3 g sampel telur (yang telah di homogenkan) kedalam tabung reaksi bertutup, tambahkan 10 ml larutan HCl (4:1) lalu vortex hingga tercampur. Untuk sampel yang diberi perlakuan spiking, sebelum penambahan HCl sampel diberi tambahan kolesterol standar sebanyak 1 ml untuk setiap konsentrasi. Dilanjutkan dengan penghembusan dengan N 2 selama 30 detik lalu tutup dengan segera untuk menghindari oksidasi kolesterol. Kemudian panaskan pada waterbath mendidih selama 30 menit, sambil dikocok setiap 5 menit. Dinginkan tabung reaksi tersebut menggunakan air mengalir. Pindahkan isi tabung ke dalam labu pemisah (250 ml), bilas tabung reaksi tersebut dengan 2 x 10 ml air bebas ion, lalu gabungkan air bilasan tersebut ke dalam labu pemisah. Cuci dengan heksan 3 x 10 ml sambil dikocok. Ambil fraksi heksan lalu uapkan fraksi heksan dengan gas N 2. Setelah kering, saponifikasi dengan 10 ml metanolik KOH 2% dengan pemanasan 80 ºC, 30 menit. Kemudian ekstrak dengan heksan 3 x 10 ml dalam labu pemisah dan saring dengan menggunakan kertas saring yang diberi tambahan Na 2 SO 4 anhidrous. Uapkan fraksi heksan dengan gas N 2. Setelah kering, larutkan dengan fase gerak pada volume tertentu (1,0 ml). Kemudian larutan tersebut diencerkan sebanyak 10 kali tingkat pengenceran. Larutan sampel ini siap diinjeksikan ke HPLC. 17
3.4.3. Pengukuran dengan HPLC-ELSD Analisis dengan HPLC-ELSD kondisi isokratik menggunakan: Fase gerak : Heksan: 2-propanol (90:10) Kolom : silica (25 cm x i.d. 4,6 cm) Laju alir : 2 ml/menit Suhu : 50 ºC Detektor : ELSD (Sedex 55) dengan tekanan gas N 2 sebesar 2,2 bar, Gain 7. Volume injeksi : 20 µl Injeksikan sampel terpisah dengan injeksi standar dengan menggunakan kondisi HPLC diatas, kemudian area respon dicatat. Buat kurva standar hubungan linier antara area dengan konsentrasi kolesterol standar. Area dari sampel dihubungkan dengan kurva standar untuk memperoleh konsentrasi kolesterol standar dari kurva (µg/ml). Lakukan perhitungan konsentrasi kolesterol dalam sampel dengan rumus: Fp = faktor pengenceran dari larutan sampel akhir apabila dilakukan pengenceran sebelum larutan diinjeksikan ke HPLC. 18