BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Benih Departemen Agronomi dan Hortikultura, IPB Darmaga pada bulan Februari April 2012. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini meliputi lima lot benih kacang hijau yaitu varietas Walet, varietas Sriti, varietas Murai, varietas Kutilang dan varietas Vima-1 yang diperoleh dari Balai Penelitian Kacang-kacangan dan Umbiumbian (Balitkabi), Malang. Bahan lainnya yaitu PEG 6000, aquades, aluminium foil, kertas stensil, plastik PE dan kertas label. Alat yang digunakan pada percobaan pertama adalah alat pengecambah benih tipe 72-1, kuas, gelas piala dan magnetic stirrer. Alat yang digunakan pada percobaan kedua yaitu oven, neraca digital, desikator, sealer, refrigerator, water bath, alat pengecambah benih IPB tipe 72-1, alat pengepres kertas, pinset dan handsprayer. Metode Penelitian Kegiatan penelitian terdiri dari tiga percobaan. Percobaan pertama yaitu pengaruh varietas dan tekanan osmotik PEG 6000 terhadap vigor kekuatan tumbuh benih terhadap kekeringan. Percobaan kedua yaitu pengaruh varietas dan kondisi CDT (kadar air, suhu serta lama penderaan) terhadap viabilitas. Percobaan ketiga yaitu uji korelasi antara VCDT pada percobaan pertama dengan VKTkekeringan pada percobaan kedua. 1. Pengaruh varietas dan tekanan osmotik PEG 6000 terhadap vigor kekuatan tumbuh benih terhadap kekeringan Percobaan ini dilaksanakan di laboratorium yang bertujuan untuk menentukan toleransi benih beberapa varietas kacang hijau terhadap cekaman kekeringan menggunakan PEG 6000 dengan berbagai tingkat tekanan osmotik.
10 Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) faktorial dua faktor dengan tiga ulangan. Faktor pertama terdiri dari lima lot benih yaitu varietas Walet, varietas Sriti, varietas Murai, varietas Kutilang dan varietas Vima-1. Faktor kedua adalah tekanan osmotik menggunakan PEG 6000 dengan lima taraf yaitu 0, -0.5, -1, -2 dan -3 bar. Kombinasi dari kedua faktor menghasilkan 25 perlakuan. Masing-masing perlakuan diulang tiga kali sehingga menghasilkan 75 satuan percobaan dengan tiap ulangan terdiri dari 50 butir benih. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (Anova) dan pada perlakuan yang menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap variabel yang diamati, maka diuji lanjut menggunakan DMRT pada taraf nyata 5%. 2. Pengaruh varietas dan kondisi CDT (kadar air, suhu, serta lama penderaan) terhadap viabilitas Percobaan yang dilaksanakan di laboratorium ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi kadar air benih dan lama penderaan yang efektif untuk menguji vigor benih. Beberapa varietas kacang hijau yang digunakan yaitu varietas Walet, varietas Sriti, varietas Murai, varietas Kutilang serta varietas Vima-1. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) dua faktor. Faktor pertama adalah lot benih dengan lima taraf yaitu L1, L2, L3, L4 dan L5. L1 = Varietas Walet L4 = Varietas Kutilang L2 = Varietas Sriti L5 = Varietas VIMA-1 L3 = Varietas Murai Faktor kedua adalah perlakuan kondisi tingkat kadar air benih (KA) dan lama penderaan (P) dengan 16 taraf yaitu: P0, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12, P13, P14 dan P15, dengan suhu penderaan 45 C. P0 = KA 20% dan penderaan 0 jam P5 = KA 22% dan penderaan 24 jam P1 = KA 20% dan penderaan 24 jam P6 = KA 22% dan penderaan 48 jam P2 = KA 20% dan penderaan 48 jam P7 = KA 22% dan penderaan 72 jam P3 = KA 20% dan penderaan 72 jam P8 = KA 24% dan penderaan 0 jam P4 = KA 22% dan penderaan 0 jam P9 = KA 24% dan penderaan 24 jam
11 P10 = KA 24% dan penderaan 48 jam P11 = KA 24% dan penderaan 72 jam P12 = KA 26% dan penderaan 0 jam P13= KA 26% dan penderaan 24 jam P14= KA 26% dan penderaan 48 jam P15= KA 26% dan penderaan 72 jam Kombinasi dari kedua faktor menghasilkan 80 perlakuan. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak tiga kali ulangan sehingga total percobaan adalah 240 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri dari 2 x 25 butir benih. Model percobaan yang digunakan adalah: Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + ρk + εijk (i = 1, 2, 3. j = 1, 2,.n. k = 1, 2, 3. ) Yijk = Nilai pengamatan pada ulangan ke-k yang memperoleh taraf ke-i faktor lot benih dan taraf ke-j faktor kondisi kadar air benih serta periode penderaan µ = Nilai tengah umum αi = Pengaruh taraf ke-i faktor lot benih βj = Pengaruh taraf ke-j faktor kondisi kadar air dan periode penderaan (αβ)ij= Pengaruh interaksi antara taraf ke-i faktor lot benih dan taraf ke-j faktor kondisi kadar air benih dan periode penderaan ρk = pengaruh kelompok ke-k εijk= Galat percobaan Uji lanjut yang digunakan terhadap hasil yang berpengaruh nyata adalah Duncans Multiple Range Test (DMRT) pada taraf nyata 5%. 3. Uji korelasi antara VCDT pada percobaan pertama dengan VKTkekeringan pada percobaan kedua Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui tingkat keeratan hubungan antara tekanan osmotik PEG 6000 terpilih dari hasil percobaan pertama dengan VCDT hasil percobaan kedua, sehingga dapat diketahui keefektifan metode CDT sebagai indikator dalam menguji ketahanan benih kacang hijau terhadap cekaman kekeringan. Berbagai variabel pengamatan hasil percobaan pertama pada tekanan osmotik PEG 6000 terpilih selanjutnya dikorelasikan dengan VCDT hasil percobaan kedua. Analisis data dilakukan dengan menggunakan analisis korelasi sederhana antara VKTkekeringan dengan VCDT. Tingkat hubungan VKTkekeringan dengan
12 VCDT ditentukan oleh nilai koefisien korelasi. Disamping itu dilakukan juga analisis regresi linier sederhana dimana variabel VCDT difungsikan sebagai faktor X dan variabel VKTkekeringan sebagai faktor Y dalam persamaan regresi tersebut. Persamaan regresi yang digunakan adalah: Yi = α + βxi Yi = Variabel VKT α = Intersep β = Kemiringan atau gradient Xi = VCDT. Pelaksanaan 1. Pengaruh varietas dan tekanan osmotik PEG 6000 terhadap vigor kekeringan Tahap awal dari percobaan ini adalah dengan menanam benih pada substrat kertas stensil. Sebelumnya substrat dilembabkan dengan larutan PEG 6000 menggunakan kuas dan volume PEG 6000 pada setiap substrat sama jumlahnya. Kertas stensil yang digunakan dalam setiap gulungan sebanyak lima lembar dengan masing-masing lembar kertas stensil membutuhkan 6 ml larutan PEG 6000. Tingkat tekanan osmotik PEG 6000 terdiri dari lima taraf 0, -0.5, -1, -2 dan -3 bar. Rumus perhitungan tekanan osmotik PEG 6000 menurut Michel dan Kaufmann (1973) adalah sebagai berikut: s = - (1.18 x 10-2 )C (1.18 x 10-4 )C 2 + (2.67 x 10-4 )CT + (8.39 x 10-7 )C 2 T s = tekanan osmotik larutan (bar) C = konsentrasi PEG 6000 dalam gram PEG/kg H2O T = suhu ruangan ( C) Metode yang digunakan untuk mengecambahkan benih adalah metode uji kertas digulung didalam plastik (UKDdp) dan selanjutnya dimasukkan ke dalam alat pengecambah benih tipe IPB 72-1.
13 2. Pengaruh varietas dan kondisi CDT (kadar air, suhu, serta lama penderaan) terhadap viabilitas Tahap awal dari pelaksanaan penelitian ini adalah membuat lot benih dari kelima lot benih yang digunakan sesuai perlakuan dengan cara meningkatkan kadar air dari setiap lot benih. Masing-masing lot benih ditingkatkan kadar airnya menjadi 20%, 22%, 24% dan 26%. Berat benih dengan kadar air yang dikehendaki diperoleh dengan menggunakan rumus: W2 = x W1 A = Kadar air awal dari benih ( % ) W1 = Berat awal benih yang telah diketahui (g) B = Kadar air yang dikehendaki ( % ) W2 = Berat benih dengan kadar air yang dikehendaki (g) Benih dimasukkan dalam alumunium foil dan ditambahkan aquades sesuai perlakuan kadar air benih dengan rumus: Aquades yang ditambahkan = W2-W1 Benih dalam alumuniun foil yang telah memiliki berat yang sesuai dimasukkan ke dalam refrigerator bersuhu 4 C dan didiamkan semalaman, agar benih berimbibisi dan diperoleh benih dengan tingkat kadar air yang diinginkan sesuai perlakuan. Benih yang telah berkadar air sesuai perlakuan dimasukkan dalam water bath bersuhu 45 C selama 0, 24, 48 dan 72 jam. Benih kemudian diuji dengan metode uji kertas digulung dalam plastik (UKDdp) kemudian dimasukkan dalam alat pengecambah benih (tipe IPB 72-1). 3. Uji korelasi antara VCDT dengan VKTkekeringan Hasil pada percobaan pertama dan percobaan kedua diuji korelasi dengan analisis korelasi sederhana antara VKTkekeringan dengan VCDT dan juga diuji menggunakan analisis regresi linier sederhana. Tingkat hubungan antara VKTkekeringan dengan VCDT ditentukan oleh nilai koefisien korelasi (r) dan didukung oleh nilai koefisien determinasi (R 2 ).
14 Pengamatan Pengamatan pada percobaan pertama dan kedua di laboratorium dilakukan terhadap beberapa variabel yaitu: 1. Vigor benih setelah cekaman kekeringan (VKTkekeringan). Pengamatan terhadap kecambah normal pada pengamatan hari kelima dan ketujuh (ISTA, 2010). VKTkekeringan (%) = + otal benih ang ditanam X 100% VKTkekeringan = % kecambah normal setelah pada kondisi cekaman kekeringan KN I = Kecambah normal pada pengamatan pertama yaitu hari kelima KN II = Kecambah normal pada pengamatan pertama yaitu hari ketujuh 2. Viabilitas benih sesudah penderaan (VCDT). Pengamatan terhadap kecambah normal pada pengamatan hari kelima dan ketujuh (ISTA, 2010). VCDT (%) = X 100% VCDT = % kecambah normal setelah CDT KN I = Kecambah normal pada pengamatan pertama yaitu hari kelima KN II = Kecambah normal pada pengamatan pertama yaitu hari ketujuh 3. Kecepatan tumbuh (KCT) Pengamatan dilakukan setiap hari terhadap pesentase kecambah normal dibagi nilai etmal. Nilai etmal kumulatif dimulai dengan waktu pengamatan dan dihitung dengan rumus penentuan kecepatan tumbuh (Sadjad et al., 1999). KCT = KCT N tn t = kecepatan tumbuh (%/etmal) = persentase kecambah normal setiap waktu pengamatan = waktu akhir pengamatan =etmal (jumlah jam saat dari tanam dibagi 24 jam) 4. Penetapan kadar air (KA) Penetapan kadar air dilakukan dengan metode langsung yaitu menggunakan oven suhu rendah pada suhu 103±2ºC selama 17 jam. Rumus perhitungan kadar air (ISTA, 2010). KA (%) = x 100%
15 Keterangan : M1 = berat wadah M2 = berat wadah + benih sebelum dioven M3 = berat wadah + benih setelah dioven 5. Indeks vigor (IV) Pengamatan dilakukan terhadap jumlah kecambah normal pada hitungan pertama (first count) yaitu pada hari ke-5. IV = x 100% 6. Panjang akar (PA) Diukur mulai dari ujung akar hingga pangkal akar dengan satuan centimeter pada pengamatan hari ketujuh terhadap kecambah normal. 7. Panjang hipokotil (PH) Diukur mulai dari pangkal akar hingga pangkal kotiledon dengan satuan centimeter pada pengamatan hari ketujuh terhadap kecambah normal. 8. Berat kering kecambah normal Kecambah normal tanpa kotiledon di oven selama 3 x 24 jam dengan suhu 60 C.