8 II. MATERI DAN METODE 2.1 Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 2.1.1 Materi Alat-alat yang digunakan dalam penelitian diantaranya ice box, autoklaf model HL36AE (Hirayama Manufacturing Corporation, Japan), erlenmeyer (IWAKI Pyrex, Japan), batang pengaduk, kompor gas (Rinnai), cawan petri (IWAKI Pyrex, Japan), tabung reaksi (IWAKI Pyrex, Japan), rak tabung reaksi, pembakar spiritus, korek api, sprayer, alumunium foil, mikropipet ukuran 1 ml dan 0,1 ml, tip ukuran 1 ml (blue tip) dan 0,1 ml (yellow tip), drugalsky, wrapping, plastik, tissue, inkubator, kamera digital (SONY ). Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian diantaranya ikan nila, agar, media selektif MRSA (de Man Rugosa Sharpe Agar), akuades, alkohol 70%, spirtus, pakan fermentasi (bahan baku: tepung enceng gondok, dedak, bungkil kelapa, ampas tahu, tepung ikan, MEP +, silage MEP ++ atau MEP tepung, dan tepung kanji), pakan komersial. 2.1.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Waduk PB Soedirman Banjarnegara dan laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan mulai bulan September 2013 sampai Febuari 2014.
9 2.2 Metode Penelitian 2.2.1 Rancangan Percobaan Penelitian dilakukan secara eksperimental dengan menggunakan rancangan dasar, yaitu rancangan acak lengkap (RAL) dengan 5 perlakuan, masing-masing dengan 4 kali ulangan sehingga didapatkan 20 unit percobaan, pengambilan sampel dilakukan sebanyak 3 kali dengan interval 2 minggu sekali. Perlakuan yang dicobakan adalah budidaya ikan nila pada keramba jaring apung dengan : A : Pemberian pakan fermentasi dengan kandungan suplemen enceng gondok 0% dengan penambahan MEP + ; B : Pemberian pakan fermentasi dengan kandungan suplemen enceng gondok 5% dan penambahan MEP + ; C : Pemberian pakan fermentasi dengan kandungan suplemen Enceng gondok 10% dan penambahan MEP + ; D : Pemberian pakan fermentasi dengan kandungan suplemen Enceng gondok 15% dan penambahan MEP + ; E : Pemberiam pakan komersial tanpa penambahan MEP +. Berikut ini denah percobaan penempatan keramba jaring apung yang dilakukan: C1 E1 A1 B1 D1 E2 B2 D2 C2 A2 A3 E3 C3 D3 B3 D4 A4 E3 B4 C4 Gambar 2.1 Denah percobaan budidaya ikan nila yang diberi pakan fermentasi limbah pertanian dengan suplemen enceng gondok dan probiotik
10 2.2.2 Variabel/Parameter yang diamati Variabel yang diamati dalam penelitian adalah variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas meliputi pakan fermentasi dengan penambahan enceng gondok yang berbeda dan probiotik MEP +. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah jumlah kepadatan bakteri asam laktat di usus ikan nila. Parameter utama yang diamati adalah kepadatan bakteri asam laktat pada usus ikan, serta parameter pendukung berupa pertambahan bobot ikan Nila serta kondisi fisika dan kimia air. Parameter fisika berupa pengukuran suhu, dan parameter kimia berupa pengukuran ph, pengukuran oksigen terlarut (DO), dan pengukuran amoniak (NH3). 2.2.3 Cara Kerja 2.2.3.1 Persiapan Keramba Jaring Apung Keramba Jaring Apung (KJA) dibuat menggunaka n jaring dan kerangka dari bambu dengan ukuran mesh 0,5 cm x 0,5 cm, tiap unit berukuran 1x1x1,2 m 3 dengan ketinggian 20 cm dari permukaan air. Jumlah keramba digunakan 20 unit, terdiri dari 4 unit untuk tiap perlakuan. 2.2.3.2 Aklimasi ikan dalam keramba jaring apung (Ghufran, 2010) Ikan nila yang digunakan dalam penelitian memiliki berat dan panjang rata-rata ikan 52,22 gr dan 14,47 cm sebanyak 1000 ekor. Ikan nila yang ditempatkan ke dalam KJA sebanyak 20 unit, yang masing-masing unitnya berisi 50 ekor ikan. Ikan nila yang digunakan pada penelitian terlebih dahulu diaklimasi selama tiga hari untuk menyesuaikan diri terhadap kondisi lingkungan
11 percobaan. Selama aklimasi ikan nila tidak diberi pakan. Ikan nila dicermati secara visual dengan memisahkan ikan yang terlihat sakit dengan ikan yang sehat 2.2.3.3 Pembuatan pakan fermentasi (Bautista, 1981) Dedak, bungkil kelapa (yang sudah diayak), dan ampas tahu ditimbang masing-masing 3 kg. Dedak, bungkil kelapa, ampas tahu dicampur hingga merata, kemudian ditambahkan tepung enceng gondok sebesar 0% untuk perlakuan A, 5% (0,45 kg) untuk perlakuan B, 10% (0,9 kg) untuk perlakuan C, 15% (1,35 kg) untuk perlakuan D. Adonan dicampur dengan MEP ++ sebanyak 75 g/1 kg bahan baku dan ditambahkan air 4 liter, kemudian diaduk kembali. Adonan difermentasi dengan cara diinkubasi selama 4 hari. Bahan baku yang telah difermentasi dicampur dengan tepung ikan, ditambah tepung kanji sebanyak 10% dari jumlah adonan dan selanjutnya dicetak. Pelet dibuat dengan kadar protein 30% menggunakan metode bujur sangkar (Pearson). 2.2.3.4 Pemberian pakan fermentasi berprobiotik Pemberian MEP + pada pakan dengan cara menyemprotkan campuran MEP + sebanyak 1 cc dan air 300 ml pada 1 kg pelet dan dibiarkan selama 10 menit sambil diratakan agar terserap merata. Pemberian pakan dilakukan dua kali sehari pada pagi dan sore hari, dengan jumlah pakan diberikan 3% dari total bobot ikan uji (Ghufran, 2010).
12 2.2.3.5 Pembuatan Media Pertumbuhan MRSA (Oxoid, 1982) Komposisi media MRSA adalah pepton 10 g, beef extract 10 g, yeast extract 5 g, K2HPO4 2 g, amonium sitrat 2 g, glukosa 2 g, sodium asetat 3H2O 20 g, MgSO4 7H2O 0,58 g, MnSO4 4H2O 0,28 g, agar 15 g, akuades 1000 ml. Media yang digunakan selama tiga kali ulangan sebanyak 720 ml. Satu kali ulangan membutuhkan media MRSA 240 ml dituang dalam 20 cawan petri steril. Media disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 2 atm dengan suhu 121 0 C selama 15-20 menit. Media pertumbuhan yang telah disterilisasi dituangkan ke dalam cawan petri steril masing-masing sebanyak 10-12 ml didiamkan hingga memadat dan di bungkus plastik cling untuk mencegah kontaminasi. 2.2.3.6 Pengambilan sampel Ikan Nila untuk Perhitungan Jumlah Bakteri Asam Laktat pada usus Ikan Nila Setiap perlakuan diambil ikan sebanyak 2-4 ekor secara acak. Ikan yang diambil kemudian dimasukkan ke dalam plastik aseptis dan disimpan dalam icebox untuk di hitung jumlah bakteri asam laktat dalam usus di Laboratorium Fakultas Biologi Unsoed. 2.2.3.7 Inokulasi sampel usus ikan Nila pada media MRSA (Lay, 1994) Ikan diambil ususnya secara aseptis sebanyak 1 g, kemudian di maserasi dengan menggunakan mortal dan pestle dan dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-4. Dua pengenceran terkhir di platting duplo secara speard plate (0,1 ml) ke dalam media MRSA lalu diratakan dengan drugalsky. Hasil platting diinkubasi 2x24 jam pada suhu 30 o C.
13 2.2.3.8 Pengamatan jumlah bakteri Lactobacillus (Lay, 1994). Cawan petri hasil isolasi dari sampel usus ikan yang ditumbuhi bakteri asam laktat dihitung jumlah koloni yang tumbuh secara SPC ( Standard Plate Count). Koloni bakteri yang tumbuh diamati bentuk morfologi koloninya dan dihitung dengan menggunakan metode Standard Plate Count (SPC). Satuan untuk bakteri asam laktat usus ikan dengan satuan CFU s/ml. Pengenceran yang digunakan secara duplo (2 cawan petri), maka jumlah angka yang digunakan adalah data dari kedua cawan, tidak boleh diambil dari salah satu, meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat diantara 30-300. 2.3 Metode Analisis Data jumlah bakteri asam laktat di usus ikan nila selanjutnya dianalisa menggunakan analisis ragam atau uji F pada tingkat kepercayaan 95% dan 99%. Kemudian dilanjutkan dengan Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) karena memberikan nilai berbeda sangat nyata (Steel dan Torrie, 1993).