LAPORAN RESMI PRAKTIKUM ANALISIS KLINIK PRAKTIKUM V PENETAPAN KADAR PROTEIN Hari/ Tanggal Percobaan : Selasa / 18 Mei 2010 Golongan/ Kelas : I / FKK 2010 Dosen Pembimbing : Muthi Ikawati,M,Sc.,Apt Asisten Jaga : Putri Damai Lestari dan Lathifa Bidarani Nama Anggota 1. Nanda Huda Ardianto (FA/08017) 2. Falita (FA/08018) 3. Niken Feladita (FA/08023) 4. Dian Tyas Ariestya (FA/08028) 5. Jou Vera Irine Riseno (FA/08029) 6. Fenny Christine Hartono (FA/08034) 7. Fadhillah Dinny Ishmatika (FA/08037) 8. Anastasia Putri Rahayu (FA/08038) 9. Fadhliyani (FA/08041) 10. Mey FhanuranieYolanda Putri (FA/08043) 11. Intan Anatasia (FA/08045) 12. Annisa Nadya Utami (FA/08046) 13. Yanita Harliana Atharini (FA/08048) 14. Anis Puji Lestari (FA/08055) 15. Muhammad Zaki Bin Illias (FA/08216) 16. Arvind Abraham (FA/08218)
I. TUJUAN Mahasiswa mampu melakukan penetapan kadar protein pada sampel plasma dengan metode spektrofotometri, metode biuret serta metode fotometri II. PRINSIP DASAR PERCOBAAN Penetapan Kadar Protein dengan Metode Spektrofotometri Mengevaluasi konsentrasi protein dan asam nukleat dari absorbansi larutan sampel pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm yang ditentukan berdasarkan prinsip pengukuran absolute dengan menggunakan suatu persamaan sederhana atau monogram. Dengan metode ini, pengukuran yang dilakukan berdasarkan gugus kromofor dan ausokrom yang dimiliki oleh suatu senyawa. Peptida + Cu 2+ OH- Senyawa kompleks warna ungu Penetapan Kadar Protein dengan Metode Biuret Senyawa dengan dua atau lebih ikatan peptida apabila direaksikan dengan garam Cu (kupri) pada suasana basa maka akan membentuk suatu kompleks warna ungu violet yang absorbansinya dapat dibaca pada panjang gelombang (λ) 546nm. Penetapan Kadar Protein dengan Metode Fotometri Dengan adanya bromocresol hijau dalam suasana asam (ph asam), maka serum albumin akan menyebabkan terjadi perubahan warna pada indikator yaitu dari warna kuning-hijau menjadi warna hijau-biru. III. ALAT DAN BAHAN Metode Spektrofotometri Bahan : Alat : 1. Sampel plasma 1. Tabung reaksi + Rak 2. Larutan NaCl 0.9% 2. Mikropipet, pipet tetes 3. Blanko NaCl 3. Yellow dan Blue Tip 4. Spektrofotometri UV
Metode Biuret Bahan : Alat : 1. Sampel plasma 1. Tabung Reaksi + rak 2. Blanko aquades 2. Mikropipet, pipet tetes 3. Pereaksi Biuret 3. Yellow dan Blue tip 4. Pereaksi basa 4. Spektrofotometri UV + kuvet 5. Baku (albumin standard) 6 % = 6 g/100ml 5. Labu takar+ beker glass 100ml Metode Fotometri Bahan : Alat : 1. Reagen albumin 1. Tabung reaksi + rak Citrate buffer ph 4.2 30 mmol/l 2. Mikropipet, pipet tetes Bromcresol green 0.26 mmol/l 3. Yellow dan blue tip 2. Standar albumin 59/dL 4. Spektrofotometri UV + Kuvet 3. Blangko akuades 5. Labu takar+ beker glass 100ml IV. Cara Kerja Metode Spektrofotometri 20μL Sampel Plasma Blanko NaCl + 1 ml NaCl + 1 ml NaCl Baca absorbansi pada λ 260 nm dan 280 nm Replikasi 2x
Metode Biuret Sampel Blanko Baku (albumin) 20μL 20μL akuades 20μL + 1 ml pereaksi biuret + 1mL pereaksi basa Baca Absorbansi pada λ 546 nm pada menit ke 30 40 setelah pencampuran Replikasi 2x Metode Fotometri Sampel Plasma Blanko Baku (albumin) 10μL 10μL akuades 10μL + 1000 μl reagen Inkubasi 10 menit, 37 C Baca Absorbansi pada λ 546 nm dalam rentang waktu 60 menit
Replikasi 2x IV. DATA DAN PERHITUNGAN Rumus perhitungan kadar protein : Konsentrasi Protein = Kadar Protein normal : 6,82-8,87 g/dl x Konsentrasi Albumin baku (g/dl) Metode Biuret Kelompok Baku : 0.144 Absorbansi4 Kadar protein (g / 100mL) I II III I II III IV 0.174 0.204 0.209 6.042 7.083 7.257 V 0.211 0.208 0.171 7.326 7.222 5.938 Xrata-rata : 6.811 mg/dl SD : 0.642 CV : 9.43% Metode Spektrofotometri Kel λ 260 λ 280 I II III Kadar Protein (g/dl) 0.827 1.246 0.1302 0.927 1.383 0.144 0.840 1.269 0.133 0.833 1.270 0.134 0.621 0.914 0.095 0.431 0.634 0.066 0.942 1.391 0.014 0.929 1.295 0.013 0.918 1.203 0.012 IV 0.993 1.491 1.556
CV = 156.70% 0.824 1.220 1.265 0.791 1.158 1.194 1.835 1.654 0.1169 V 1.834 1.264 0.0565 2.041 1.672 0.1041 X rata-rata : 0.3356 SD : 0.5259 Metode Fotometri Kelompok Kadar protein (g/dl) Absorbansi 2.429 0.377 I 3.125 0.485 2.293 0.356 6.7525 1.048 II 5.831 0.905 5.277 0.819 3.602 0.559 III 3.376 0.524 3.151 0.489 Baku : 0.776 Xrata-rata : 3.982 g/dl SD : 1.580 CV : 39.68% V. INTERPRETASI HASIL Kadar Protein normal : 6,82 8,87 g/dl. Pada percobaan kali ini, konsentrasi protein rata rata (1 golongan) yang diperoleh dari penetapan dengan metode biuret adalah 6.81 g/dl
Dan konsentrasi protein rata-rata yang diperoleh dari penetapan dengan metode spektrofotometri dengan monogram 0.3356 gg/dl Dan konsentrasi protein rata-rata yang diperoleh dari penetapan dengan metode fotometri 3.982 g/dl. VI. JAWABAN PERTANYAAN Metode Spektrofotometri 1. Apakah kepentingan penetapan kadar protein dalam analisis klinik? Untuk mengindikasikan adanya suatu penyakit dan gangguan fungsi ginjal Untuk mengetahui kinerja dari suatu enzim 2. Apakah dasar penetapan kadar protein secara spektrofotometri? Penetapan konsentrasi protein dan asam nukleat pada suatu senyawa yang memiliki gugus kromofor dan ausokrom, dengan menggunakan persamaan sederhana (nomogram) berdasarkan prinsip pengukuran absolute dan dilakukan pembacaan absorbansi pada λ 280 nm dan 260 nm. 3. Apakah syarat metode ini dapat digunakan? Syarat suatu senyawa bisa dianalisis menggunakan metode ini yaitu senyawa tersebut harus memiliki gugus kromofor dan ausokrom. 4. Gangguan apa yang terdapat dalam metode ini? Adanya logam-logam berat yang masih terdapat dalam sampel plasma sehingga dapat mengganggu dalam pembacaan nilai absorbansi. Contoh : logam Fe dalam darah. Ada senyawa-senyawa lain yang memiliki gugus kromofor dan ausokrom dapat ikut terukur 5. Apa kelemahan metode spektrofotometri UV dalam penetapan kadar protein? Seyawa lain non protein yang memiliki gugus kromofor dan ausokrom bisa ikut terukur Tidak bisa untuk senyawa yang tidak memiliki gugus kromofor dan ausokrom Hasil tidak representatif karna hanya bisa analisis untuk asam amino aromatis Gangguan terhadap asam nukleat lebih besar dibandingkan metode biuret
6. Pelajarilah cara lain untuk penetapan kadar protein! Metode Folin Ciolteu Metode ini untuk mengukur asam amino aromatis (triptofan dan tirosin). Namun metoda ini kurang representatif karna hanya mengukur asam amino aromatis yang memiliki ausokrom dan kromofor. Contoh : fenilalanin tidak bisa terdeteksi karna tidak memiliki ausokrom. Metode Kjeldahl Metode yang digunakan untuk mengukur %nitrogen dan semua organik-n ditetapkan. Namun kurang representatif karna senyawa-n tidak hanya terdapat pada protein, sehingga metode ini kurang spesifik. Metode FeCl3 Protein dapat diendapkan dengan asam tannat. Kompleks asam tannat/protein yang terjadi dapat bereaksi dengan ion Ferri membentuk kompleks stabil berwarna merah. Metode Biuret 1. Apa kelebihan penetapan kadar protein cara Biuret dibanding metode spektrofotometri UV? Lebih spesifik, karna yang diukur lebih kepada ikatan peptida. Sehingga semua protein dapat terukur (protein memiliki ikatan peptida) Lebih spesifik untuk polopeptida dan protein Gangguan terhadap asam nukleat lebih sedikit 2. Apa dasar penetapan kadar protein cara Biuret? Senyawa dengan dua atau lebih ikatan peptida apabila direaksikan dengan garam Cu (kupri) pada suasana basa maka akan membentuk suatu kompleks warna ungu violet yang absorbansinya dapat dibaca pada panjang gelombang (λ) 546nm. 3. Tulis reaksi yang terjadi pada penetapan kadar protein cara biuret? Jelaskan mengapa warna terbentuk! Reaksi warna bisa terjadi karna ion Cu 2+ merupakan golongan transisi yang orbital d nya tidak penuh. Sehingga terjadi transisi elektron pada senyawa kompleks (ligan- ion
logam) dari orbital d yang satu ke orbital d lainnya. Transisi ini terjadi dari ligan yang kaya elektron ke ion Cu 2+ yang miskin elektron. Cu 2+ / OH 4. Apa kelebihan albumin sebagai standar dalam penetapan kadar protein? Karna berkaitan dengan liver Bisa mengetahui asupan nutrisi seseorang cukup atau tidak Struktur dan sifat sudah diketahui pasti Kemurnian tinggi Harga relatif murah Larutan stabil pada pemanasan 70 C, 30 menit Lebih dari 95% protein berupa albumin dengan ikatan peptida sampai 99% Impurities (pengotor) sangat kecil 5. Gangguan apa yang terdapat dalam metode ini? Terjadi efek Tyndall karna kekeruhan tipis namun bisa dikurangi dengan penambahan eter dan KCN Senyawa lain non-protein yang memiliki 2 ikatan peptida / lebih juga bisa ikut ditetapkan, sehingga dapat mengganggu analisis. Contoh : inti benzen Senyawa yang hanya memiliki 1 ikatan peptida tidak bisa dianalisis. Contoh : parasetamol 6. Apakah senyawa pengganti albumin sebagai standar dalam percobaan ini? Senyawa yang bisa menggantikan albumin yaitu casein
Metode Fotometri 1. Jelaskan prinsip penetapan kadar protein menggunakan metode fotometri dengan bromocresol green? Dengan adanya bromocresol hijau dalam suasana asam (ph asam), maka serum albumin akan menyebabkan terjadi perubahan warna pada indikator yaitu dari warna kuning-hijau menjadi warna hijau-biru. 2. Sebutkan dan jelaskan komponen dan fungsi reagen pada pertanyaan nomor 1! Reagen albumin terdiri dari Citrate buffer ph 4.2 30 mmol/l dan Bromcresol green 0.26 mmol/l, berfungsi sebagai pembentuk warna dengan memperpanjang kromofor sehingga terbentuk warna hijau-biru. VII. DAFTAR PUSTAKA Fessenden dan Fessenden, 1986, Kimia Organik Jilid 2 ed III, Erlangga ; Jakarta. Poedjadi, Anna, 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI, Press ; Jakarta. Richterich, R dan Colombo, J.P, 1981, Clinical Chemistry, Theory, Practice and Interpretation ; John Wiley and Sons ; Chichester.