PENGARUH SUHU DAN WAKTU INKUBASI PADA UJI STANDARISASI HORMON PROGESTERON Anne Sukmara Balai Penelitian Ternak Ciawi, P.O. Box 221, Bogor 16002 RINGKASAN Hormon merupakan substansi penting dalam pengaturan fungsi fisiologis tubuh, karenanya sering kali diperlukan data mengenai kadar hormon di dalam cairan tubuh (termasuk darah) pada penelitian yang berkaitan dengan fisiologi produksi dan reproduksi. Salah satu hormon yang berperan dalam kelangsungan fisiologi reproduksi adalah progesteron. Metode analisis yang sering digunakan untuk penentuan kadar progesteron adalah den gan teknik Radioimmunoassay (RIA), dimana dalam hal ini digunakan isotop H- Progesteron sebagai perunut. Salah satu bahan lain yang diperlukan adalah antiserum spesifik, yang secara komersial tersedia di pasaran. Akan tetapi, antiserum serupa juga dapat dibuat, seperti yang dilakukan di Balai Penelitian Ternak (AS-BPT 331). Dalam kaitannya dengan penggunaan antiserum tersebut dalam analisis progesteron, serangkaian percobaan telah dilakukan untuk menguji pengaruh berbagai waktu dan suhu inkubasi dalam preparasi bahan untuk analisis secara RIA. Kombinasi waktu dan suhu yang digunakan untuk inkubasi adalah selama 2 dan 16 jam pada 4 dan 28 C, dengan serangkaian konsentrasi standar progesteron sebanyak 0 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 ; 2 ; 4 ; 8 dan 16 ng/ml. Hasil percobaan menunjukkan adanya inkonsistensi penurunan % daya ikat antiserum - antigen pada perlakuan dengan masa inkubasi 2 jam pada suhu 28 C, yang berbanding terbalik dengan peningkatan kadar progesteron standar. Sedangkan untuk % standar relatif, nilainya menurun secara konsisten untuk setiap kombinasi perlakuan waktu dan suhu inkubasi, berbanding terbalik dengan peningkatan kadar progesteron standar, dengan pola kurva berbentuk linier hingga sigmoid. Dari data yang diperoleh, kombinasi suhu dan waktu inkubasi terbaik adalah pada suhu 4 C selama 16 jam. Pada pengujian kadar progesteron dalam plasma sapi, hasil terbaik juga dicapai pada perlakuan masa inkubasi 16 jam dengan suhu 4 C maupun 28 C, dengan nilai pengembalian (recovery) kadar progesteron sebesar 80%. Kata kunci : Inkubasi, progesteron, radioimmunoassay PENDAHULUAN Hormon adalah suatu substansi kimia yang dihasilkan oleh kelenjar endokrin yang berfungsi mengatur dan mengkatalisa proses metabolisme di dalam organ atau jaringan sasaran (Shahib, 1984). Struktur kimia hormon 165
dapat berupa protein, polipeptida, asam amino (amina), atau steroida. Struktur kimia ini penting untuk identifikasi dan aktivitas biologisnya. Hormon progesteron merupakan hormon steroid, salah satu hormon reproduksi wanita/betina yang disintesa di dalam korpus luteum, plasenta, dan korteks adrenal. Aktivitas fisiologis hormon ini muncul setelah ovulasi, yaitu untuk mempersiapkan uterus pada saat menerima embrio, merangsang perkembangan kelenjar susu, dan bersama-sama hormon folikel berperan dalam siklus haid. Hormon merupakan suatu substansi yang kadar/ konsentrasinya sangat kecil di dalam serum atau plasma. Oleh karenanya, diperlukan cara khusus untuk mendeteksinya, dan cara yang umum dilakukan adalah dengan menggunakan teknik Radioimmunoassay (RIA). Teknik ini mempunyai tingkat efisiensi tinggi, karena dapat mengukur suatu substansi yang konsentrasinya sangat rendah, dalam satuan mikrogram, nanogram, bahkan hingga pikogram. Radioimmunoassay adalah suatu teknik pengukuran kadar hormon dengan cara menghitung jumlah hormon yang berikatan dengan radioaktif penanda. Reaksi ini tergantung pada reaksi kompetisi antara Antigen Progesteron di dalam contoh (Ag) dan penanda/perunut 3 H-Progesteron (Ag) untuk berikatan pada Antibodi (Ab) spesifik progesteron (Horrock, 1974). Reaksi antara Ag dan Ag terhadap antibodi berlangsung selama inkubasi, di mana suhunya hares stabil agar proses reaksi berjalan dengan baik. Suhu dan waktu inkubasi ini berpengaruh terhadap perolehan hasil analisis. Faktor suhu dan masa inkubasi merupakan faktor yang saling berkaitan, keduanya mempengaruhi daya gabung dan kepekaan reaksi. Oleh karenanya, dalam metode penggunaan RIA, selalu dilakukan pengukuran kadar hormon pada standar untuk melihat hasil pengikatan yang tinggi, dengan menentukan suhu dan waktu inkubasi optimum. Makalah ini mengulas penentuan waktu dan suhu inkubasi optimum untuk pengukuran kadar hormon progesteron. Bahan dan Alat BAHAN DAN METODE Untuk standar progesteron, perlu dipersiapkan serangkaian larutan dengan berbagai konsentrasi progesteron dari 0 hingga 16 ng/ml (0 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 ; 2 ; 4 ;8 dan 16 ng/ml). Untuk keperluan pengujian pengaruh suhu dan waktu inkubasi dalam ketepatan pengukuran kadarnya, diperlukan pula bahan contoh plasma sapi berupa Plasma-1 dan Plasma-2, yang sebelumnya telah diketahui kadar progesteronnya (masing-masing 0,5 dan 2,0 ng/ml). Untuk keperluan kalibrasi larutan standar tersebut di atas, dibuat juga larutan pengikat plasma non-spesifik (Plasma Non Specific Binding/PNSB) dan larutan pengikat penyangga non-spesifik (Buffer Non Specific Binding/BNSB) berupa larutan fosfat ph 7,4. Untuk mengikat antigen, digunakan antiserum tertentu (AS-BPT 331). Sedangkan untuk penanda/perunut seberapa banyak progesteron yang 1 66
Lokakarya Fungsionai Non Peneliti 1997 terikat oleh antiserum, disiapkan isotop 3 H-Progesteron (aktivitas 30-120 Ci/mmol). Selain itu, dibuat larutan karbon aktif dekstran, yang diperlukan untuk pemisahan antigen yang terikat dan yang tidak terikat. Larutan sintilasi (scintillation) diperlukan untuk menghitung jumlah 3 H-Progesteron yang terikat. Pembacaan jumlah 3H-Progesteron dilakukan dengan menggunakan Spektrometer Sintilasi Karbon Cair model Packard 3255. Metode Analisis Masing-masing larutan standar, plasma, PNSB dan BNSB dipipet sebanyak 100.td, dengan dua ulangan. Ke dalam larutan tersebut kemudian ditambahkan 100 µl Antiserum, kecuali pada PNSB dan BNSB ditambahkan larutan dapar 100µd, kemudian dikocok. Selanjutnya ditambahkan juga 100 41 perunut radioaktif 3H-Progesteron dan dikocok kembali. Inkubasi dilakukan sesuai dengan beberapa perlakuan suhu dan waktu, yaitu pada suhu ruang (28 C) selama 2 jam ; 28 C selama semalam (16 jam) ; pada 4 C selama 2 jam ; dan 4 C selama 16 jam. Setelah diinkubasi, ditambahkan 1 ml larutan karbon aktif dekstran, lalu dikocok. Setelah itu, disentrifus selama 15 menit pada suhu 4 C dengan kecepata 2400 rpm. Kemudian supernatan dituang ke dalam botol pencacah dan ditambahkan 10 ml larutan sintilasi. Botol ditutup dan dikocok kembali, selanjutnya ditempatkan pada Spektrometer Sintilasi Karbon Cair untuk pembacaan jumlah 3H-Progesteron. Dari jumlah 3 H-Progesteron yang terhitung, kadar Progesteron dalam plasma dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut B standar/contoh Aktivitas Daya Ikat (%) = x 100 Total Count Standar Relatif (%) B standar/contoh Bo (0 Standar) x100% Keterangan B Standar Bo (0 Standar) Total Count = Rata-rata jumlah 3H-Progesteron (cpm) dalam standar = Rata-rata jumlah 0 Standar = Total Radioaktif HASIL DAN PEMBAHASAN Dad hasil perhitungan daya ikat dan standar relatif progesteron pada percobaan ini. Pada perlakuan masa inkubasi selama 2 jam pada berbagai suhu inkubasi baik suhu 4 C maupun suhu 28 C untuk pengukuran kadar hormon progesteron pada kasus ini kurang layak digunakan dalam preparasi sampel dengan metode RIA. Hal ini disebabkan hasil yang diperoleh tidak mengalami 1 6 7
penurunan yang stabil atau reaksi belum mencapai kesetimbangan (Tabel 1). Sementara itu pada kondisi inkubasi 28 C selama 16 jam, walaupun sudah mencapai kesetimbangan atau penurunan hasil yang stabil, namun kandungan/ konsentrasi yang diperoleh lebih rendah bila dibandingkan dengan kondisi inkubasi 4 C selama 16 jam (Tabel 2). Tabel 1. Hasil perhitungan daya ikat dan standar relatif progesteron pada berbagai suhu dan waktu inkubasi Suhu lnkubasi Kadar Standar Daya Ikat (%) Standar Relatif (%) ( C) (ng/ml) 2 jam 16 jam 2 jam 16 jam 0 37,0 40,7 100,0 100,0 0,25 31,8 39,9 87,8 98,3 0,5 32,0 34,3 88,4 86,6 4 1 26,3 33,3 74,7 84,5 2 20,4 28,6 61,0 74,5 4 14,6 21,9 47,4 60,5 8 10,8 17,9 38,3 51,9 16 7,3 13,6 30,2 42,9 0 26,3 32,0 100,0 100,0 0,25 22,6 28,0 87,8 90,5 0,5 24,4 27,6 93,8 89,3 28 1 25,6 24,3 94,3 81,4 2 19,4 21,1 77,0 73,7 4 15,3 17,9 63,3 65,9 8 9,9 13,2 45,3 54,6 16 7,9 11,7 38,7 51,1 Karena adanya saling keterkaitan antara suhu dan waktu inkubasi terhadap pengukuran kadar hormon progesteron, maka hasil yang lebih baik dicapai dengan bertambah lamanya masa inkubasi, dan hal ini konsisten untuk kedua perlakuan suhu inkubasi. Artinya jumlah progesteron yang terdeteksi juga akan sempurna. Hal ini perlu ditekankan, karena tidak berlaku sama untuk jenis hormon lainnya. Menurut Horrock (1974), setiap hormon memiliki spesifikasi dalam hal afinitasnya dengan antibodi. Bila dilihat dari hasil persen standar relatif dan persen daya ikat yang diperoleh, kondisi inkubasi dan waktu yang paling balk untuk berlangsungnya reaksi pengikatan terdapat pada kombinasi perlakuan suhu 4 C dengan waktu inkubasi salama 16 jam. Dalam kondisi tersebut, reaksi mencapai kesetimbangan, hal ini tampak dari kecenderungan (pola) penurunan nilai persen daya ikat yang konsisten berbanding terbalik dengan peningkatan kadar standar progesteron (Gambar 1 dan Tabel 1). 1 6 8
Tabel 2. Hasil analisis kadar progesteron dalam plasma sapi pada berbagai suhu dan masa inkubasi Kadar Suhu Waktu Kadar "Pengembalian Progesteron Inkubasi Inkubasi Progesteron (Recoven) Plasma (ng/ml) ( C) (jam) (ng/ml) Progesteron (%) 4 2 0,7 140 Plasma-1 (0,5) 16 0,4 80 28 2 0,2 40 16 0,4 80 4 2 1,4 70 Plasma-2 (2,0) 16 1,7 85 28 2 1,9 95 16 1,5 75 *Nilai pengembalian (recoven) ditentukan terhadap kadar progesteron plasma WL A Y a 4 s N Kadar Stander Progcatcron (nghnl) 1-4 C ; 2 jam +4 C; 16 jam " "'28 C; 2 jam )K29 C; 16 jam I Gambar 1. Kurva standar relatif pada berbagai suhu dan waktu inkubasi Untuk mengetahui kadar progesteron yang terdapat di dalam contoh, biasanya digunakan kurva standar dimana dibuat grafik hubungan persen standar relatif (% B/Bo) terhadap kadar standar progesteron (ny/ml) yang telah diketahui sebelumnya, dengan cara memplotkan nilai kadar H-Progesteron. (Gambar 1). Semakin tinggi kadar standar progesteron, daya ikat dan persen relatif standar semakin rendah, dengan kecenderungan (pola) penurunan 1 69
Lokakarya Fungsionai Non Peneliti 1997 kurva berbentuk linier hingga sigmoid. Kecenderungan tersebut dikarenakan semakin tingginya kadar standar progesteron mengakibatkan semakin sedikitnya kesempatan untuk berkompetisi antara Ag (berlabel) dan Ag tak bertanda) untuk mengikat antibodi. Dalam gambar, kurva pada kondisi suhu inkubasi 4 C terlihat lebih linier, juga daya ikat selama 16 jam dengan kondisi suhu yang berbeda menunjukkan hasil lebih baik atau lebih sensitif karena dapat mengukur kadar progesteron lebih optimum. Walaupun demikian, kondisi inkubasi pada suhu 4 C selama 16 jam masih lebih sensitif/baik. Plum-1 (0.5 ng/ml) Plum-2 (2.0 ng/ml) Gambar 2. Kadar Progesleron Plasma M4 C ; 2 jam M4 C; 16 jam 2g C; 2 jam M29 C ; 16 jam Tingkat pengembalian (rekoven) kadar progesteron pada berbagai suhu dan masa inkubasi Perlakuan suhu dan waktu inkubasi kemudian diuji pula pada plasma sapi (Tabel 2). Dari perbandingan hasil pada Plasma-1 dengan suhu inkubasi 4 C selama 16 jam, tingkat pengembalian (rekoven) progesteron yang diperoleh mencapai 80%, atau kesetimbangan tercapai pada konsentrasi standar progesteron 0,4 ng/ml, sedangkan pada plasma 2 mencapai 85%. Pada kondisi suhu inkubasi 4 C selama 2 jam, tingkat rekoveri progesteron lebih tinggi 40% (Plasma 1), sementara pada Plasma 2 lebih rendah 30%. Pada kondisi inkubasi suhu 28 C selama 2 jam tingkat rekoveri mencapai 95%, tetapi pada Plasma 1 hanya mencapai 40%, lebih rendah 60% dari kadar contoh. Hal ini berhubungan dengan daya ikat dan standar relatif yang diperoleh, pada kondisi ini reaksi belum mencapai kesetimbangan karena tidak mengalami penurunan yang stabil (Tabel 1). Pada kondisi inkubasi suhu 28 C selama 16 jam, rekoveri progesteron lebih rendah dari suhu 4 C selama 16 jam. Pada Plasma 1 menunjukkan 80 %, tetapi pada Plasma 2 hanya 75% 170
atau Iebih rendah. Dapat disimpulkan untuk penentuan kadar progesteron plasma darah sebaiknya dilakukan pada 4 C selama 16 jam (Gambar 2). KESIMPULAN Hasil percobaan menunjukkan adanya saling keterkaitan antara suhu dan waktu inkubasi terhadap persen daya ikat progesteron. Kondisi suhu inkubasi yang Iebih rendah (4 C) dan waktu yang lebih lama (16 jam) menghasilkan kesetimbangan atau daya ikat yang lebih tinggi. Kesempurnaan pengembalian (rekoveri) konsentrasi progesteron dipengaruhi oleh lamanya inkubasi daripada suhu inkubasi. DAFTAR BACAAN Horrocks, D. L. 1974. Applications of Liquid Scintillation Counting. Academic Press, Inc., New York, USA. IAEA. 1984. Laboratory Training Manual on Radioimmunoessay in Animal Reproduction. International Atomic Energy Agency, Vienna. Jaffe, B. M. 1974. Methods of Hormone Radioimmunoessay. Academic Press, Inc., New York, USA. Shahib, N. M. 1984. Ringkasan Biokimia Hormon. Universitas Padjadjaran, Bandung. 1 7 1