II. MATERI DAN METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian 1.1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu Erlenmeyer, 1.2. Bahan beaker glass, tabung reaksi, cawan petri, tangkai Drugalsky, pipet ukur, filler, spatula, jarum inokulasi, kompor gas, timbangan analitik, hot plate, magnetic stirrer, kulkas standar, autoclave, oven, inkubator, alat penggiling, ayakan, evaporator, pembakar spirtus, spuit, gunting, mikroskop, pipet tetes, pipet ukur, sprayer alkohol, tabung eppendorf, baki, spektrofotometer, dan ph meter. Bahan-bahan yang digunakan terdiri dari kultur bakteri asam laktat (isolat Bifidobacterium sp. koleksi laboratorium Mikrobiologi Fak. Biologi UNSOED), NaOH 1 N, indikator fenolftalein, glukosa, etanol 96%, reagen Arsenomolibdat, reagen Nelson,Talas (C. esculenta), media MRS Agar dan media MRS Broth, alumunium foil, spirtus, kapas, tissue, label, wrapper, akuades steril, alkohol 70 %. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto selama bulan April - Agustus 2014. B. Metode Penelitian 1. Rancangan Percobaan Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimental dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial dan setiap perlakuan diulang tiga kali. Faktor pertama yaitu media MRSB dengan konsentrasi ekstrak talas (C. esculenta) dan faktor kedua adalah waktu inkubasi. a. Media MRSBdan penambahan ekstrak talas (C. esculenta): I0 = media MRSB + 0% Ekstrak Talas (C. esculenta) dari volume MRSB I1 = media MRSB + 1 % Ekstrak Talas (C. esculenta) dari volume MRSB I2 = media MRSB + 2 % Ekstrak Talas (C. esculenta) dari volume MRSB I3 = media MRSB + 3 % Ekstrak Talas (C. esculenta) dari volume MRSB b. Waktu inkubasi 5
K1 = Inkubasi 48 Jam K2 = Inkubasi 96 Jam K3 = Inkubasi 144 jam Sehingga menghasilkan 12 kombinasi perlakuan yaitu: I0K1, I1K1, I2K1, I3K1, I0K2, I1K2, I2K2, I3K2, I0K3, I1K3, I2K3, I3K3. Masingmasing perlakuan diulang 3 kali sehingga terdapat 36 unit percobaan. 2.Variabel dan parameter penelitian Variabel bebas yang digunakan adalah konsentrasi ekstrak talas (C. esculenta) dalam media MRSB dan lama inkubasi, adapun variabel tergantung adalah populasi bakteri Bifidobacterium sp. Parameter utama yang diamati adalah jumlah Bifidobacterium sp., dan parameter pendukungnya adalah total asam laktat, total gula reduksi dan ph. 3. Cara Kerja 3.1. Sterilisasi Alat (Hadioetomo, 1990) Alat-alat laboratorium yang digunakan disterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 121 o C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit. 3.2. Pembuatan tepung talas (Nuraida, 2006) Pembuatan tepung talas diawali dengan pengupasan umbi talas segar dan pencucian yang dilanjutkan dengan pengirisan dan perendaman dalam air untuk mencegah proses pencoklatan. Kemudian dilakukan pengeringan menggunakan oven pada suhu ±75 C selama 24 jam. Hasil pengeringan berupa keripik talas kemudian digiling untuk menghasilkan tepung talas dan diayak dengan ayakan. 3.3. Pembuatan Ekstrak Talas (C. esculenta) Tepung talas diekstraksi menggunakan etanol 96% dengan pengadukan selama 24 jam menggunakan shakerorbital pada suhu ruang. Larutan disaring dan residu pada kertas saring dicuci dengan etanol 96%. Larutan yang telah disaring dipisahkan dari etanol menggunakan evaporator sehingga diperoleh larutan oligosakarida pekat. Larutan stok tersebut disimpan dalam lemari es. 3.4. Pembuatan Media (Bridson, 1998) Lampiran 2 dan 3. 3.5. Peremajaan Isolat Bifidobacterium sp. 6
Disiapkan media miring MRSA sebagai media tumbuh bakteri Bifidobacterium sp. yang akan diremajakan. Isolat Bifidobacterium sp. diambil dengan menggunakan jarum inokulum, lalu di streak pada media miring MRSA untuk diremajakan kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37 o C. 3.6. Pembuatan Kultur Bifidobacterium sp. Pembuatan kultur dilakukan dengan mengambil kultur cair isolat Bifidobacterium sp. sebanyak 1 ml (± 2,13 x 10 8 cfu/ml) kemudian dimasukkan ke dalam 24 ml media MRS Broth lalu diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 o C. 3.7. Pengujian ekstrak talas untuk menstimulir pertumbuhan Bifidobacterium sp. Sebanyak 0,1 ml kultur Bifidobacterium sp. ditambahkan pada tabung reaksi berisi 10 ml media yang ditambahkan dengan ekstrak talas sebanyak 0% (kontrol), 1 %, 2 %, dan 3 %. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 48 jam, 96jam, dan 144 jam. Pengukuran pertumbuhan dilakukan dengan mengukur absorbansi suspensi bakteri pada panjang gelombang 600 nm. Sebagai blanko digunakan medium yang tidak diinokulasi kultur Bifidobacterium sp. 3.8. Pengukuran Total Asam Laktat (Apriyanto et al., 1989) Medium pertumbuhan diambil sebanyak 2 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, selanjutnya diencerkan dengan akuades sebanyak 20 ml dan dikocok, diberi 3 tetes indikator pp, kemudian dititrasi dengan larutan NaOH 1 N hingga tepat terbentuk warna merah muda. Perhitungan total asam laktat dilakukan menggunakan rumus: ( ) Keterangan : V :Volume Larutan NaOH (ml) N : Normalitas Larutan NaOH B : Volume Sampel (ml) BM asam laktat : 90 Satuan total asam laktat dalam % 3.9. Penghitungan Jumlah Sel dengan Menggunakan Total Plate Count (TPC) (Lay, 1994) Penghitungan menggunakan metode TPC dilakukan menggunakan teknik pour plate. Bakteri yang diinkubasi selama 48 jam, 96 jam, dan 144 jam diambil 1 ml dengan pipet ukur, dilakukan pengenceran pada 9 ml akuades hingga pengenceran 10-6, plating duplo pada dua pengenceran terakhir, yaitu 10-5 dan 7
10-6 sebanyak 1 ml pada cawan secara pour plate kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2x24 jam. Jumlah sel dihitung berdasarkan jumlah koloni lalu dikalikan dengan faktor pengenceran dengan rumus sebagai berikut : Keterangan : Fp : faktor pengenceran pp : pour plate (1 ml) Satuan jumlah sel TPC adalah CFU/ml 3.10. Pengukuran Derajat Keasaman (ph) Medium (Hadioetomo, 1990) Nilai ph medium diukur menggunakan ph meter digital dengan cara sebagai berikut: ph dikalibrasi menggunakan larutan buffer 7, 4 dan 10, lalu elektroda ph meter dicelupkan ke dalam medium selama 10 menit atau sampai ph meter menunjukkan angka yang konstan, nilai ph yang tercantum pada ph meter merupakan nilai ph medium yang diukur. 3.11. Pengukuran kadar gula reduksi dilakukan dengan metode Nelson- Somogyi (Sudarmadji et al., 1989) Pengukuran kadar gula reduksi dilakukan untuk mengetahui kadar gula reduksi awal dan akhir fermentasi. Pengukuran dilakukan dengan menyiapkan kurva standar terlebih dahulu kemudian dilanjutkan dengan pengukuran kadar gula reduksi sampel. 1. Penyiapan kurva standar Larutan glukosa standar 10% dibuat dengan cara mencampurkan 10 mg glukosa anhidrat dengan 100 ml akuades, dilakukan pengenceran dari larutan glukosa standar tersebut sehingga diperoleh larutan glukosa dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8 mg dalam 100 ml akuades. Larutan glukosa standar dimasukkan kedalam tabung reaksi, masing-masing diisi sebanyak 1 ml, dan satu tabung diisi 1 ml akuades sebagai blanko. Masing-masing tabung ditambahkan 1 ml reagen Nelson dan dipanaskan pada penangas air mendidih selama 20 menit. Tabung diambil dan segera didinginkan bersama-sama dalam gelas piala yang berisi air dingin hingga suhu mencapai 25 o C. reagen Arsenomolibdat ditambahkan kedalam tabung sebanyak 1 ml, dikocokhingga semua endapan Cu 2 O larut kemudian ditambahkan 7 ml akuades setelah semua endapan Cu 2 O larut sempurna dan dikocok hingga homogen, lalu diambil 3 ml dan dimasukkan ke dalam 8
kuvet. Penghitungan Optical Density (OD) dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kurva standar yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi glukosa dan OD dibuat dengan menggunakan rumus. 2. Penentuan kadar gula reduksi sampel Kadar gula reduksi larutan sampel ditentukan dengan cara disiapkan sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dilakukan pengenceran hingga 10-4 dan pengenceran terakhir diambil 1 ml kemudian ditambahkan reagen Nelson dan dipanaskan pada penangas air mendidih selama 20 menit. Tabung diambil dan didinginkan dalam gelas piala yang berisi air dingin hingga suhu mencapai 25 o C lalu ditambah 1 ml reagen Arsenomolibdat, dikocok sampai semua endapan Cu 2 O larut. Endapan Cu 2 O yang telah larut sempurna ditambah 7 ml akuades dan dikocok hingga homogen, lalu diambil 3 ml dan dimasukkan ke dalam kuvet. Absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Jumlah gula reduksi ditentukan berdasarkan absorbansi larutan sampel yang diplotkan ke dalam kurva standar larutan glukosa. C. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) atau uji F pada tingkat kesalahan 5% dan 1%, perlakuan berpengaruh tidak nyata sehingga tidak dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Jujur (BNJ) (Steel dan Torrie, 1993). 9