20 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April hingga Juni 2011 di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku, Laboratorium biokimia, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Laboratorium Biologi Hewan dan Laboratorium Nutrisi dan Biologi Radiasi, Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. Laboratorium Mikroteknik dan Anatomi Tumbuhan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. 3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman kangkung air (Ipomoea aquatica Forsk.) diperoleh dari Desa Sinarsari, Kecamatan Dramaga, Bogor. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk analisis proksimat meliputi akuades, kjeltab jenis selenium, bromcherosol green, methyl red, larutan H2SO4, asam borat (H3BO3), larutan HCl 10% larutan HCl 0,0947 N, pelarut lemak (n-heksana p.a.), dan larutan AgNO3 0,10 N. Bahan yang digunakan dalam analisis mineral adalah daun dan batang tanaman kangkung air, KH2PO4, H2SO4, HNO3, akuades, ammonium molibdat, H2NO3, dan HClO4. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis mikroskopis meliputi daun dan batang tanaman kangkung air, larutan Toluidin blue dan air. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau silet, cawan porselen timbangan, oven, meja pemanas, gelas obyek, dan rak pewarna. mikroskop cahaya merk Olympus tipe CH20 dan kamera mikroskop merk Olympus DP12. oven, labu takar, labu kjeldahl, alat Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) Novva 300, dan alat spektrofotometri Spektronik 20, wadah porselen, tanur, labu soxhlet, labu kjeldahl, alat destilasi, labu erlenmeyer, kertas saring, dan corong Buchner, meja cetak, karton cetak, oven. 3.3 Metode Penelitian Penelitian dilakukan dalam beberapa tahapan yang terdiri dari tahap pengambilan dan preparasi sampel, analisis histologis kangkung air, analisis
21 proksimat daun dan batang kangkung air segar dan kukus, kandungan mineral kangkung air segar dan khusus. Secara umum tahap penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 6 Kangkung Air ( Ipomoea aquatic Forsk.) 1. pengambilan dan preparasi sampel 2. Analisis histologis daun, batang, dan akar. 3.Analisis proksimat kangkung air segar dan kukus 4. Analisis mineral kangkung air segar dan khusus Gambar 6. Diagram alir Metode Penelitian 3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel Proses pengambilan sampel meliputi pengambilan sampel tanaman kangkung air dari Desa Sinarsari, Dramaga. Tanaman kangkung diambil dengan memilih tanaman yang ukurannya telah cukup untuk dikonsumsi (berdasarkan keterangan warga setempat). Selanjutnya diambil secara acak ± 30 batang tanaman kangkung air (ukuran minimal sampel), dikarakterisasi (diukur luas daun, panjang dan tebal batang, panjang akar dan rendemen) dan disimpan dalam coolbox agar tidak layu sampai tiba waktunya dianalisis. 3.3.2 Analisis histologi pembuatan preparat dengan metode preparat segar Pengamatan jaringan tanaman diawali dengan pembuatan preparat segar tanaman kangkung air (Ipomoea aquatica Forsk.) kemudian pengambilan gambar objek pada mikroskop. Tahapannya terdiri atas persiapan dan pemotongan bagian daun, akar dan batang dengan ukuran 1-2 cm atau secukupnya, letakkan potongan tersebut diatas obyek kaca preparat, lalu teteskan air secukupnya agar sampel tidak mengering, letakkan sampel diatas meja mikroskop stereo, kemudian tekan (kunci) sampel tersebut dengan jari telunjuk kiri agar tidak bergeser. Gunakan silet yang baru dengan tangan kanan, tempelkan silet diujung jari telunjuk kiri,
22 lakukan pemotongan sampel dibawah mikroskop stereo setipis mungkin kemudian pisahkan potongan terbaik dengan jarum pentul, teteskan kembali sampel dengan air, pindahkan obyek glass yang telah terisi sampel pilihan di meja sampel mikroskop eletrik, dan lakukan pengamatan preparat. Diagram alir pembuatan preparat segar dapat dilihat pada Gambar 7. Tanaman kangkung air Persiapan dan pemotongan Peletakkan di kaca preparat Penetesan air Penyayatan melintang Pengamatan Gambar 7 Diagram alir pembuatan preparat dengan metode preparat segar 3.3.3. Analisis proksimat Analisis proksimat dilakukan terhadap tanaman kangkung air segar dan setelah pengukusan dengan ulangan sebanyak 3 kali. Analisis proksimat terdiri atas kadar air, kadar abu, kadar protein kasar, kadar lemak kasar, dan serat kasar. 1) Kadar air (AOAC 2007) Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 ºC selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (± 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan, sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 ºC selama 5 jam. Setelah selesai proses,
23 cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali. Perhitungan kadar air sampel adalah: % Kadar air = x 100 % 2) Kadar abu (AOAC 2007) Preparasi sampel tanaman untuk zat mineral adalah dengan menghilangkan seluruh bahan asing dari sampel, terutama tanah yang melekat atau pasir, namun untuk mencegah terjadinya pelepasan, maka tidak mencuci sampel secara berlebihan. Sampel segera dikeringkan untuk mencegah dekomposisi atau kehilangan berat. Sampel sebanyak 2 gram ditimbang dalam porselen dan tempatkan dalam suhu terkontrol dari tanur yang dipanaskan hingga 600 ºC. Pengabuan berlangsung selama 2 jam. Porselen segera dipindahkan ke dalam desikator untuk didinginkan dan penimbangan berat akhir sampel. % (w/w) abu = x 100 % 3) Kadar protein kasar (AOAC 2007) Tahap dalam analisis kadar protein terdiri atas destruksi, destilasi, dan titrasi. Analisis kadar protein dilakukan dengan metode Kjeldahl. Sampel sebanyak 0,7-2,2 gram dimasukkan ke dalam labu destruksi kemudian ditambahkan 0,7 gram HgO atau 0,65 metallic Hg, 15 gram serbuk K 2 SO 4 atau Na 2 SO 4 serta 25 ml H 2 SO 4. Labu kemudian ditempatkan dalam posisi miring dan dipanaskan secara perlahan hingga buih menghilang. Larutan sampel dididihkan hingga larutan jernih pada suhu 410 ºC selama ± 2 jam. Sampel didinginkan dan ditambahkan 200 ml H 2 O, 25 ml larutan sulfida atau tiosulfat serta dicampurkan dengan percepatan Hg. Selanjutnya, sampel ditambahkan sedikit bubuk Zn dan ditambahkan 15 gram NaOH. Kemudian, labu dihubungkan ke pipa destilasi pada kondensor. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 yang berisi 25 ml asam borat (H 3 BO 3 ) 4% yang mengandung indikator bromcherosol green 0,1 % dan methyl red 0,1 % dengan perbandingan 2:1. Erlenmeyer digoyangkan perlahan untuk mencampurkan hasil destilasi dan
24 labu dipanaskan hingga seluruh NH 3 terdestilasi ( 150 ml hasil destilasi). Hasil destilasi kemudian dititrasi dengan larutan standar NaOH atau standar HCl 0,2 N hingga terjadi perubahan warna merah muda yang pertama kalinya.volume titran dibaca dan dicatat. Kadar protein saat HCl standar digunakan adalah: % N = Kadar protein saat H 2 SO 4 standar digunakan adalah: % N= 4) Kadar lemak kasar (AOAC 2007) Sampel sebanyak 1-5 gram (S) yang mengandung 100-200 mg lemak dimasukkan ke dalam selongsong selulosa. Banyaknya sampel berdasarkan kandungan lemaknya: Lemak kasar (%) Berat sampel (g) < 2 5 5 2-4 10 1-2 >20 1 Selongsong yang berisi sampel dikeringkan pada suhu 102 ºC ± 2 ºC selama 2 jam. Pelarut dan sampel harus bebas dari air untuk mencegah ekstraksi komponen yang larut air. Kapas bebas lemak dapat ditambahkan sebagai penutup selongsong sebelum pengeringan. Ekstraktor dipanaskan dan kondensor pendingin dinyalakan. Tabung ekstraksi kosong ditimbang sebagai T. Selongsong dimasukkan ke dalam tabung ekstraksi dan sejumlah pelarut heksan ditambahkan ke dalam tabung ekstraksi hingga menutupi sampel. Tabung ekstraksi ditempatkan di bawah kolom ekstraksi. Selongsong dibenamkan ke dalam pelarut dan dididihkan selama 20 menit. Selongsong diangkat dari pelarut lalu diekstraksi kembali selama 40 menit. Selanjutnya, pelarut dalam tabung didestilasi hingga menjadi murni dan mencapai kondisi kering. Tabung ekstraksi dipindahkan dari ekstraktor dan ditempatkan dalam proses penguapan untuk menyelesaikan evaporasi pelarut pada suhu rendah.
25 Tabung ekstaksi kemudian dikeringkan dalam 102 ºC ± 2 ºC selama 30 menit untuk menghilangkan kelembaban. Selanjutnya, tabung ekstraksi didinginkan pada suhu ruang dalam desikator dan ditimbang sebagai F. % Lemak kasar (ekstrak heksan) = x 100% 5) Kadar serat kasar (AOAC 2007) Ekstrak sampel sebanyak 2 gram (W1) dengan eter ataupun petroleum eter dimasukkan ke dalam gelas piala 600 ml dan ditambahkan 0,25-05 gram bumping granule, kemudian ditambahkan 200 ml H 2 SO 4 1,25 % yang hampir mendidih. Larutan dididihkan selama 30 menit dan digoyangkan secara berkala. Kemudian larutan disaring dengan kertas saring dan bantuan corong Buchner lalu divakumkan pada tekanan 25 mm Hg. Residu dibilas dengan air yang hampir mendidih sebanyak 40-50 ml sebanyak 4 kali, kemudian disaring. Residu dari kertas saring + corong Buchner dibilas dengan NaOH 1,25 % yang hampir mendidih ke dalam gelas piala dan direfluks selama 30 menit. Kemudian larutan disaring dan divakum kembali. Residu dibilas kembali dengan air yang hampir mendidih. Residu kembali dibilas dengan 25-30 ml H 2 SO 4 1,25 % (hampir mendidih) sebanyak 1 kali dan dibilas dengan 20-30 ml air (hampir mendidih) sebanyak 2 kali lalu. Residu beserta kertas saring dikeringkan pada suhu 130 ± 2 ºC selama 2 jam atau semalam pada 110 ºC dan didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang (W2). Residu + kertas saring diabukan pada suhu 550 ºC ± 10 ºC selama 2 jam, didinginkan dalam desikator dan ditimbang (W3). Serat kasar % = x 100% W2 W3 : Bobot residu sebelum diabukan tanpa kertas saring dan cawan : Bobot residu setelah diabukan tanpa cawan 3.3.4 Analisis mineral tanaman kangkung air dengan Atomic Absorption Spectrophotometer (Reitz et al. 1987) Sampel kangkung air yang akan mengalami pengujian mineral dilakukan proses pengabuan basah terlebih dahulu. Pada proses pengabuan basah, sampel ditimbang sebanyak 1 g, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 150 ml. Ke
26 dalam labu ditambahkan 5 ml HNO 3 dan dibiarkan selama 1 jam. Labu ditempatkan di atas hotplate selama ± 4 jam dan ditambahkan 0,4 ml H 2 SO 4 pekat, campuran (HClO 4 dan HNO 3 ) sebanyak 3 tetes, 2 ml akuades dan 0,6 ml HCl pekat. Larutan contoh kemudian diencerkan menjadi 100 ml dalam labu takar. Sejumlah larutan stok standar dari masing-masing mineral diencerkan dengan menggunakan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merek Novva300 dengan panjang gelombang dari masing-masing jenis mineral. Langkah selanjutnya adalah pengukuran absorbansi atau tinggi puncak standar, blanko dan contoh pada panjang gelombang dan parameter yang sesuai untuk masing-masing mineral dengan spektrofotometer. Setelah diperoleh absorbansi standar, hubungkan antara konsentrasi standar (sebagai sumbu y) dengan absorban standar (sebagai sumbu x) sehingga diperoleh kurva standar mineral dengan persamaan garis linier y = ax+b (dimana y: variable terikat ; a: kemiringan gradient ; x: variable bebas ; b: konstanta) yang digunakan untuk perhitungan konsentrasi larutan sampel. Konsentrasi larutan sampel dihitung dengan mengalikan a dengan absorbansi contoh.