III. MATERI DAN METODE 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian ini telah dilakukan pada bulan September-Oktober 2013. Pemeliharaan ayam penelitian, aplikasi ekstrak temulawak dan vaksinasi AI dilakukan di kandang ayam UIN Agricultre Research and Development Station (UARDS). Pemeriksaan laboratorik dilakukan di Laboratorium Virologi Balai Penyidikan Penyakit Veteriner (BPPV) Regional II Baso Bukittinggi. 3.2. Alat dan Bahan Alat yang digunakan meliputi kandang ayam yang dilengkapi dengan tempat pakan, tempat air minum, lampu pemanas, semprotan untuk desinfeksi, kapur dan koran bekas untuk menampung feses. Alat yang digunakan untuk pembuatan ekstrak herbal adalah timbangan, panci, pisau dan kompor. Peralatan lain yang digunakan adalah peralatan isolasi virus Avian influenza (test tube, centrifuge, spuit Terumo dosis volume 1 cc dan inkubator dengan suhu 37 0 C). peralatan untuk uji HA (Haemaglutinasi) dan HI (Haemaglutinasi Inhibisi) meliputi microplate bentuk V, mikropipet multichannel 10-50 µl dan microshaker. Bahan yang diperlukan meliputi ayam pedaging, ayam petelur (layer) dan ayam arab masing-masing sebanyak 24 ekor. Bahan lainnya adalah temulawak, dan bahan-bahan kimia untuk pemeriksaan laboratorik terhadap darah. 3.3. Metode Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan desain Pre-test dan Post-test menggunakan kelompok kontrol dan penugasan random (Soendari, 23
2013). Peubah yang akan diukur dalam penelitian ini adalah titer antibodi yang meliputi : 1. Titer antibodi terhadap virus Avian influenza pada ayam ras pedaging (HI unit). 2. Titer antibodi terhadap virus Avian influenza pada ayam ras petelur (HI unit). 3. Titer antibodi terhadap virus Avian influenza pada ayam lokal (Arab) (HI unit). 3.4. Prosedur Kerja Tahapan pekerjaan dalam penelitian ini terdiri atas 1) persiapan kandang dan perlengkapannya; 2); pembuatan ekstrak temulawak 3) pemeliharaan ayam percobaan dan perlakuan; 4) koleksi spesimen darah; 5) pengiriman dan pemeriksaan laboratorik terhadap spesimen darah; dan 6) analisis data. Tahapan di atas dapat diuraikan sebagai berikut: 1. Persiapan Kandang dan Pemeliharaan Ayam Persiapan kandang perlakuan dilakukan dua minggu sebelum pelaksanaan penelitian. Lantai kandang terlebih dahulu dibersihkan dan disemprot dengan desinfektan (Rodalon) agar kandang tersebut bebas dari kuman dan bakteri. Kandang dilengkapi dengan satu tempat pakan, tempat minum dan lampu. Lantai kandang adalah kawat yang berukuran kecil dan dibuat tempat penampungan feses. Pemeliharaan ayam percobaan dan perlakuan. Setiap jenis ayam terdiri atas 24 ekor dan masing-masing dikelompokkan menjadi 2 (dua) 24
yaitu kontrol (tidak diberi ekstrak temulawak) dan perlakuan (diberi ekstrak temulawak). Prosedur yang harus dikerjakan adalah : - Ayam ras pedaging dipelihara sejak umur 20 hari. Ekstrak temulawak diberikan setiap hari sebanyak 1 ml sejak umur 21 hari hingga 28 hari dengan cara cekok. Vaksinasi AI dilakukan pada umur 28 hari. Pakan yang diberikan berasal dari PT. Charoen Pokphand Jaya Farm Tbk. tipe 311 VIVO dan air minum diberikan secara ad libitum. - Ayam ras petelur dipelihara sejak umur 40 hari. Ekstrak temulawak diberikan setiap hari sebanyak 1 ml sejak umur 43 hari hingga 50 hari dengan cara cekok. Vaksinasi AI dilakukan pada umur 50 hari. Pakan yang diberikan Pakan yang diberikan berasal dari PT. Charoen Pokphand Jaya Farm Tbk. tipe Hi-Pro-Vite medicate 521 dan air minum diberikan secara ad libitum. - Ayam lokal (Arab) dipelihara sejak umur 40 hari. Ekstrak temulawak diberikan setiap hari sebanyak 1 ml sejak umur 43 hari hingga 50 hari dengan cara cekok. Vaksinasi AI dilakukan pada umur 50 hari. Pakan yang diberikan Pakan yang diberikan berasal dari PT. Charoen Pokphand Jaya Farm Tbk. tipe Hi-Pro-Vite medicate 521 dan air minum diberikan secara ad libitum. 2. Pembuatan Ekstrak Temulawak Ekstrak temulawak dibuat di Laboratorium Patologi, Entomologi dan Mikrobiologi Fakultas Pertanian dan Peternakan UIN Sultan Syarif Kasim Riau. Ekstraksi dilakukan dengan pemanasan, yaitu dengan cara merebus 25
temulawak, dimana cara ini juga sekaligus dapat mengurangi jumlah mikroba awal (Sihombing, 2007). Untuk mendapatkan 200 ml ekstrak temulawak diperlukan 200 gr temulawak dan 300 ml aquades. Temulawak dipotong tipis-tipis kemudian dicampurkan dengan 300 ml aquades untuk direbus. Perebusan dilakukan selama 15 menit. Hasil perebusan dimasukan kedalam gelas ukur sebanyak 200 ml. Kemudian dimasukan kedalam wadah dan didinginkan. Prosedur ekstraksi temulawak sebagai berikut : Temulawak Temulawak ditimbang Dipotong tipis-tipis dan dicuci bersih Direbus selama ± 15 menit Air rebusan dipisahkan dan didinginkan Gambar 3.1. Proses Pembuatan Ekstrak Temulawak 3. Pengambilan Sampel Koleksi spesimen darah (serum) melalui vena Brachialis sebanyak 2 ml. Darah diambil menurut Ernawati et al. (2007) dengan menggunakan spuit secara aseptik lalu dibiarkan hingga terjadi pemisahan serum (dibiarkan sedikit ruang udara pada spuit), kemudian serum darah 26
dipindahkan ke dalam tabung eppendof, apabila serum darah kurang jernih maka serum tersebut perlu disentrifuse dengan kecepatan 1.500 rpm selama 10 menit. Setelah itu dilakukan inaktifasi serum dalam penangas air (waterbath) selama 20-30 menit pada suhu 56 0 C, lalu disimpan pada suhu -20 0 C sampai saat diperiksa. Jadwal koleksi serum darah ketiga jenis ayam dilakukan pada 2 (dua) minggu setelah vaksinasi. Serum dikirim ke laboratorium untuk pemeriksaan titer antibodi. 4. Uji Serologis Pemeriksaan serologis dapat dilakukan untuk mengetahui adanya pembentukan antibodi terhadap virus Avian influenza yang dapat diamati pada hari ke 7-10 pascainfeksi. Pemeriksaan serologis meliputi uji haemaglutinasi (HA) dan uji haemaglutinasi inhibisi (HI). Uji HA merupakan salah satu uji serologis yang sederhana, cepat dan sensitif untuk mendeteksi antibodi. Prinsip kerja uji ini adalah mereaksikan antibodi dengan antigen yang sesuai dengan cara serum diencerkan seri 2 kali, direaksika dengan antigen virus Avian influenza 4 HA unit, kemudian direaksikan dengan eritrosit ayam 0,5%. Uji HA dikatakan positif apabila aktivitas hemaglutinasi ditandai dengan tidak adanya titik mengalir dari sel darah merah tersebut. Satu unit HA ditentukan berdasarkan pengenceran tertinggi yang masih memberikan hemaglutinasi komplit. Hasil uji HA dikatakan negatif jika tidak terlihat adanya aktivitas hemaglutinasi pada setiap lubang pengenceran. 27
3.5. Analisis Data Data penelitian berupa titer antibodi, total leukosit dan persentase limfosit dianalisis dengan menggunakan uji t (t -test) untuk melihat perbedaan rata-rata antara kelompok kontrol dan perlakuan. Persamaman uji t tersebut sesuai dengan Riwidikdo (2008). Adapun rumus yang digunakan adalah : t = dimana nilai s diperoleh dari rumus : S = ( ) keterangan : S : Simpangan baku : Jumlah sampel pada kelompok 1 : Jumlah sampel pada kelompok 2 : Rata-rata sampel 1 : Rata-rata sampel 2 : Varian sampel 1 : Varian sampel 2 Kaidah : 1. Jika t hitung > t tabel maka H 0 ditolak, artinya terdapat perbedaan yang signifikan antara kaedah kelompok sampel. 28
2. Jika t hitung < t tabel maka H 0 diterima, artinya tidak dapat perbedaan signifikan antara kaedah kelompok sampel. 29