DESAIN DAN PEMODELAN MOLEKUL TURUNAN 1,3-DIBENZOIL TIOUREA SEBAGAI INHIBITOR CHK1 SECARA IN SILICO Ruswanto, Taufik Hidayat 1 1 Program Studi Farmasi STIKes BTH Tasikmalaya *Coresponding author : ruzhone@yahoo.com ABSTRAK Pencarian obat antikanker terus dilakukan salah satunya pencarian inhibitor Check point kinase 1 yang mampu meningkatkan level apoptosis sel kanker. Telah dilakukan skrining virtual inhibitor Check point kinase 1 dari derivat 1,3-dibenzoylthiourea dengan menggunakan perangkat lunak PLANTS 1.1 (Protein-Ligand ANT System). Dari 23 senyawa yang di-docking pada Check point kinase 1 didapat 5 senyawa dengan energi ikatan paling stabil yaitu, 1,3 bis ( { [ 3-dimethylamino ) phenyl ] carbonyl } ) thiourea, 1,3-bis ( { [ 4- (dimethylamino)-3- methylphenyl] carbonyl}) thiourea, 1,3-bis ( { [ 3-(trifluoromethyl) phenyl] carbonyl } ) thiourea, 1,3-bis ( { [ 4-( dimethylamino ) -3- methylphenyl ]carbonyl})thiourea dan 1,3-bis ( {[4-chloro-3- (trifluoromethyl)phenyl] carbonyl})thiourea dengan energi ikatan berturut - turut -95,6248, -92.9495, -92,5560, -92,5509 sedangkan untuk (UCM) native ligand adalah -95.3636. Terdapat kesamaan interaksi antara UCM ( native ligand ) yaitu dengan senyawa 1,3 bis ( { [ 3-dimethylamino ) phenyl ] carbonyl } ) thiourea dimana keduanya berinteraksi dengan 7 residu yaitu Lys 132, Ile 131, Ile 146, Asn 135, His 128, Leu136 dan Asp 130. Hal tersebut menunjukan bahwa 1,3 bis ( { [ 3-dimethylamino ) phenyl ] carbonyl } ) thiourea diprediksi memiliki aktivitas inhibitor Check point kinase 1 yang memiliki energi ikatan paling stabil menurut metode docking. Key words: Check point kinase 1, Thiourea, Docking PENDAHULUAN Pencarian khemoterapi antikanker adalah sebuah tantangan sulit. Beberapa terapi memiliki target tumor sel yang spesifik. Tujuan dari terapi antikanker sendiri adalah untuk membunuh sel kanker tanpa merusak sel sehat. Dalam hal ini, inhibitor Checkpoint kinase 1 (Chk1) dapat meginduksi kematian sel kanker (Prudhomme,2005). Pencarian obat antikanker terus dilakukan salah satunya pencarian inhibitor Chk1. Peran dari Chk1 pada respon seluler terhadap stress replikasi DNA (Deoxyribonucleic Acid) sudah diketahui secara baik. Bagaimanapun, penelitian terakhir mengindikasikan peran baru Chk1 dalam penekanan apoptosis diikuti dengan gangguan pada replikasi DNA atau kerusakan DNA. Hal ini akan mempertimbangkan penemuan-penemuan terkait jalur signaling Chk1 yang telah diketahui dan aplikasi terapi yang potensial dengan target Chk1 (Meuth, 2010). Dari beberapa pustaka diketahui bahwa tiourea memiliki aktifitas antikanker melalui inhibisi Chk1. 1.3 dibenzoil tiourea adalah salah satu derivat tiourea. Aktivitas Thiourea sebgai antikanker dan inhibitor Chk1 dengan mempertahankan thiourea sebgagai gugus utama dan benzoyl sebagai gugus sampingya banyak dibuktikan oleh penelitian-penelitian. Diantaranya,thiourea yang tersubtitusi 1,4 pyrazine yang memiliki aktifitas inhibitor Chk1 dan antikanker (keisicki, 2009) Berdasarkan hal tersebut, maka saya ingin membuktikan secara in silico untuk menggambarkan interaksi antara suatu molekul sebagai ligan dengan suatu reseptor atau protein, sehingga perilaku ligan sebagai inhibitor ataupun 14
agonis dapat diketahui sehingga obat terhadap suatu penyakit akan jauh lebih cepat ditemukan untuk mengungkapkan kandidat bagi pengobatan efektif. Oleh karena itu saya membuat usulan proposal penelitian yang berjudul Desain dan pemodelan molekul turunan 1,3-dibenzoil tiourea sebagai inhibitor Chk1 secara in silico TINJAUAN PUSTAKA Kanker Kanker adalah pertumbuhan sel yang tidak normal yang menyerang organ dengan cepat sehingga fungsinya hancur dan menyebabkan kematian. Kanker bisa disebabkan faktor genetik dan lingkungan. Di Indonesia dan dunia tiap tahun kasus kanker terus meningkat. Mulai dari yang tertinggi kanker payudara, kanker leher rahim (serviks), kanker paru, Kanker usus besar (kolorektal), kanker prostat, kanker darah, kanker tulang, kanker hati, kanker kulit. Setidaknya di dunia ada lebih dari 100 jenis kanker. Menurut Franks L. M. dan Teich N. M. (1998), sel kanker itu timbul dari sel normal tubuh kita sendiri yang mengalami transformasi menjadi ganas, karena adanya mutasi spontan atau induksi karsinogen (bahan/agen pencetus terjadinya kanker). Transformasi sel itu terjadi karena mutasi gen yang mengatur pertumbuhan dan diferensiasi sel, yaitu proto-onkogen dan atau suppressor gen (anti onkogen). Sedangkan paparan karsinogen antara lain berbagai jenis virus, bahan kimia dan radiasi, ultraviolet. Sebagian besar karsinogen tersebut memiliki sifat biologis yang sama yaitu dapat mengakibatkan kerusakan pada DNA. Kesamaan sifat ini menimbulkan dugaan bahwa DNA sel merupakan sasaran utama semua bahan karsinogenik dan bahwa kanker disebabkan perubahan DNA sel (Kresno, 2003). Apabila perbaikan DNA karena adanya perubahan DNA tersebut gagal, maka terjadi mutasi genom. Adanya mutasi mengakibatkan pengaktifan onkogen pendorong pertumbuhan, perubahan gen yang mengendalikan pertumbuhan, serta penonaktifan gen supresor kanker. Ketiga hal tersebut mengakibatkan timbulnya neoplasma ganas atau lebih dikenal dengan kanker (Kumar et al., 2003). Reseptor Chk-11 Peran dari Chk1 pada respon seluler terhadap stress replikasi DNA sudah diketahui secara baik. Bagaimanapun, penelitian terakhir mengindikasikan peran baru Chk1 dalam penekanan apoptosis diikuti dengan gangguan pada replikasi DNA atau kerusakan DNA. Hal ini akan mempertimbangkan penemuan penemuan terkait jalur signaling Chk1 yang telah diketahui dan aplikasi terapi yang potensial dengan target Chk1. 15
Pada gambar di atas, respon Chk1 terhadap stres replikasi DNA dalam cara ATR-dependent untuk memicu cekpoin S-phase, menekan firing yang tidak tepat terhadap origin replikasi DNA yang terlambat atau samar, dan menjaga integritas replication fork. Ketika signaling pathway dari ATR-Chk1 ini ditekan, menunjukkan meningkatnya level apoptosis sel yang diakibatkan lepasnya kontrol dari firing origin replikasi. Penelitian lain menunjukan bahwa kombinasi inhibitor Chk1 dengan Obat Khemoterapi lainya, adalah sebuah strategi untuk meningkatkan efikasi dari Obat obat Antikanker, dan mungkin menghindari resistensi dari Obat-Obat Antikanker. BAHAN DAN METODE Alat AMD A6 Vision dengan spesifikasi CPU @ 1.4 GHz, 4 GB of RAM, dan perangkat lunak seperti Pendrivelinux, MarvinSketch versi 5.2, YASARA versi 9.10, Molegro Molecular View dan PLANTS 1.1. Bahan Pada penelitian docking ini digunakan kompleks protein ligand dari www.rcsb.org dengan kode1nvs dan 23 turunan 1,3-dibenzoylthiourea yang dimodifikasi dengan metode topliss. METODE Preparasi Ligand 1,3- dibenzoylthiourea dan turunannya. Pemodelan 2D ligand 1,3-dibenzoil tiourea dan turunannya dilakuakan dengan cara menggambar ligand pada MarvinSketch klik tools dan lakukan protonasi pada ph 7,4. Ligand disimpan dengan tipe file.mrv. Kemudian lakukan Conformational search lalu simpan hasil pencarian konformasi dengan tipe file.mol2. Prosedur di atas dilakukan untuk setiap ligand turunan 1,3 dibenzoil tiourea (Purnomo, 2011). Preparasi Reseptor (Protein) Protein didapatkan dari Protein Data Bank (PDB) dipreparasi kembali dengan program YASARA. Untuk kemudian dibuat tiga file yaitu file protein yang akan di-docking, file ligand yang akan diuji dan file ligand pembanding hasil kristalografi sinar-x. Semua file disimpan dengan tipe file.mol2 (Purnomo, 2011). Docking ligand pembanding Tiga file yang diperoleh dari preparasi protein kemudian didocking dengan menggunakan program PLANTS.1.1 yang dihubungkan oleh program co-pendrivelinux. Akan diperoleh besarnya nilai best score dari ligand pembanding (asli) yang nantinya akan dibandingkan dengan nilai best score dari ligand 1,3- dibenzoil tiourea dan turunannya. Langkah selanjutnya adalah menghitung besarnya nilai RMSD pose hasil docking dengan referensi hasil eksperimen/struktur kristal dengan program YASARA (Purnomo, 2011). Docking ligand uji terhadap reseptor dan visualisasi hasil docking Docking dilakukan oleh native ligand dan ligand 1,3-dibenzoil tiourea serta turunannya dengan menggunakan program PLANTS.1.1 yang dihubungkan oleh program copendrivelinux. Dari hasil docking diperoleh nilai best score ligand uji, nilai inilah yang akan dibandingkan dengan nilai best score ligand asli. Kemudian membuat file hasil docking dari masing-masing ligand uji dengan program YASARA (disimpan dengan tipe file.pdb). Langkah 16
selanjutnya file hasil docking inilah yang akan divisualisasi dan diinterpretasi untuk diketahui interaksi-interaksi molekul yang terjadi (Purnomo, 2011). HASIL DAN PEMBAHASAN Pengobatan Kanker dengan target aktif Check point kinase 1 telah banyak diteliti, meskipun demikian pencarian inhibitor Check point kinase 1 sebagai terapi baru anti kanker masih perlu dilakukan untuk mendapatkan obat yang lebih aktif dan selektif. Dibawah ini adalah target aktif yaitu Check point kinase 1 dan inhibitornya yang menjadi target pengobatan kanker dalam penelitian ini. Validasi reseptor dan Docking Validasi reseptor dilakukan dengan cara me- re-docking kembali UCM ada Check point kinase1 dari hasil validasi ini kita dapat mengetahui apakah File PDB yang di download bisa digunakan untuk docking senyawa turunan yang menjadi bahan peneltian. Data yang diperhatikan adalah Root Mean Square Deviation (RMSD) dari koordinat ligand yang di re-docking dibandingkan dengan koordinat ligan dari hasil kristalografinya. Dari hasil perhitungan RMSD menggunakan Yasara maka dapat diperoleh RMSD sebesar 0,1929 Å, Dengan RMSD sebesar itu maka parameter yang digunakan dalam redocking menghasilkan konformasi yang mirip dengan konformasi yang diperoleh dari kristalografi sinar- x. Seperti diketahui bahwa minimal RMSD yang diterima adalah 2 Å, Sehingga metode docking ini dapat digunakan untuk screening virtual dari senyawa yang diteliti. Gambar 1. Perbandingan konformasi struktur kristal UCM (merah) dan hasil simulasi docking dengan PLANTS (hijau). Visualisasi dan Analisa Hasil Docking Docking senyawa 1,3-dibenzoil tiourea dan turunannya pada reseptor Check point kinase 1 dengan menggunakan program PLANTS, maka dapat diperoleh data sebagai berikut : Energi Ikatan UCM dengan reseptor Chk1 dapat dilihat pada tabel.1 yaitu sebsesar -95,3636. Nilai energi ikatan ini dibandingkan dengan Energi ikatan senyawa turunan tiourea yang diteliti. Dari Gambar 2 dan 3 dapat dijelaskan bahwa native ligand dengan reseptor Chk1 terjadi ikatan hidrogen, untuk asam amino yang berinteraksi pada ikatan ligand 17
reseptor adalah Lys 132, Leu 136, Ile131, Asn 135, His 128, Ile 145 dan Asp 130 ( 7 residu). Gambar 2. Interaksi docking antara UCM dengan Chk1 ; ikatan hidrogen garis utus - putus (biru) Molegro Molecular Viewer. Gambar 3. Interaksi docking antara UCM dengan Reseptor Chk1 dengan program Molecular Operating Environment (MOE). 18
Tabel 3. Interaksi Ligand - Protein dengan program MOE No. Subtitusi Interaksi 1 Native ligand Lys 132, Leu 136, Ile 131, Asn 135, His 128 2 Induk Lys 132, Ile 146, Asn 135, Ile 131 3 4-Cl Asp 130, Leu 136, His 128, Asn 135, Ser 147, Ile 131, Lys 132 4 3,4-Cl2 His 128, Ile 131, Ile 146, Leu 136, Asp 130, Lys 132 5 4-Cl, 3-CF3 Asp 130, His 128, Ile 131, Asn 135, Lys 132, Leu 136, Ile 146 6 4-CF3 Leu 136, Asn 135, His 128, Lys 132, Asp 130, Pro 133, Ile 131 7 4-Br Asp 130, Leu 130, Ile 131, Asn 135, Lys 132 8 4-I Ile 131, Leu 136, Asp 130, Lys 132, Asn 135 9 2,4-Cl2 Leu 136, Ile 131, Asn 136, His 128, Lys 132, Ile 146 10 4-CH3 His 128, Val 118, Leu 121, Asp 190, Ile 131, Ile 146 11 3-Cl Asn 135, His 128, Leu 136, Leu 114, Ile 146, Ile 131, Lys 132 12 3-N(CH3)2 Lys 132, Ile 146, Ile 131, Asn 135, His 128, Leu 136, Asp 130 13 3-CH3 Leu 136, Lys 132, Pro 133, Asn 135, Ile 131, Ile 146, Asp 130, His 128 14 2-Cl Lys 132, Asp 130, Asn 135 Ile 131, Leu 136 15 2-CH3 Leu 114, Ile 131, Leu 136, Ile 146, His 128 16 2-OCH3 Leu 121, Ile 131, Asp 190, Val 118, His 128 17 4-F Lys 132, Asp 130, Asn 135, Ile 131, Leu 136, His 128 18 4-C(CH3)3-19 3-CF3 Asp 130, His 128, Ile 131, Asn 135, Lys 132, Leu 136, Ile 146 20 3,5-Cl2 Asp 130, Ile 146, Asn 135, His 128, Ile 131, Leu 136, Lys 132 21 4-OCH3 Asp 190, Leu 121, Thr 127, Ile 131, Arg 129, His 122, His 128 22 4-N(CH3)2 Leu 136, Ile 131, Asn 135, His 128, Asp 130, Lys 132, Ile 146 23 4-OH Lys 132, Ser 147, Asn 135, Ile 146, Asp 130, His 128, Ile 131, Leu 136 24 4-OCH(CH3)2 Ile 146, His 128, Ile 131 25 3-CH3, 4- Asp 130, Leu 136, Ile 146, Ile 131, His 128, Asn 135, Lys 132 N(CH3)2 Tabel 1 menunjukan bahwa senyawa hipotetik memenuhi aturan Lipinksi sehingga dapat diprediksi bahwa senyawa mampu menembus membran sel kecuali untuk subtitusi 4-Cl, 3- CF3 yang memiliki 12 akseptor donor yang tidak memenuhi aturan Lipinski. Pembahasan Dari hasil docking tabel 1. 19 menggunakan PLANTS 1.1 didapat data energi ikatan antara UCM (native ligand) dan reseptor Chk1 sebesar -
95,3636, energi ikatan ini dibandingkan dengan senyawa turunan tiourea yang sedang diteliti. Data energi ikatan menunjukan satu senyawa memiliki energi ikatan yang lebih rendah yaitu 1, 3 - bis ( { [3 - dimethylamino) phenyl ] carbonyl } ) thioureayaitu subtituen (3- N(CH3)2 dengan energi ikatan - 95,6248 hal ini menunjukan ikatan yang lebih stabil dibandingkan dengan senyawa native ligand UCM sehingga dapat diprediksi bahwa 1,3-bis({ [3- dimethylamino) phenyl] carbonyl} ) thiourea dapat menginhibisi enzim Chk1 lebih kuat dibanding UCM. Selain itu aktivitas sebagai inhibitor Chk1 didukung oleh ikatan hidrogen yang terjadi antara 1,3-bis ( { [3- dimethylamino) phenyl] carbonyl} )thiourea dan senyawa turunan tiourea yang lainnya. Gambar 4. Interakrasi docking antara 1,3-bis({[3-dimethylamino) phenyl] carbonyl} ) thiourea subtituen 3-N(CH3)2 dengan reseptor Chk1 dengan program MOE. Pada gambar 3. interaksi ligand-protein yaitu UCM dapat dilihat bahwa residu yang berinteraksi adalah Lys 132, Ile 131, Ile 146, Asn 135, His 128, Leu 136 dan Asp 130 sebanyak 7 residu memiliki kesamaan dengan interaksi ligand-protein pada Gambar 4. yaitu 1,3 bis ({[ 3-dimethylamino) phenyl] carbonyl} ) thiourea yang berinteraksi dengan residu Lys 132, Ile 131, Ile 146, Asn 135, His 128, Leu 136 dan Asp 130 yang memiliki energi ikatan paling stabil diantara 23 turunan thiourea. Pada tabel 2. terlihat dari 5 senyawa turunan 1,3-dibenzoylthiourea senyawa dengan subtituen 4-Cl, 3-CF3 tidak memenuhi aturan lipinski artinya senyawa ini memiliki absorbsi buruk karena memiliki 12 akseptor ikatan 20 hidrogen yang pada aturan lipinski dibatasi hanya 10 akseptor ikatan hidrogen. Dari data interaksi protein dengan ligand dapat diperoleh bahwa residu yang berinteraksi hampir dengan semua derivat thiourea adalah Lys 132, His 132, Leu 136 dan Asn 135. Dapat dinyatakan, derivat 1,3- dibenzoylthiourea yang yang diteliti, dapat diprediksi memiliki aktivitas sebagai inhibitor Chk1 yang meningkatkan level apoptosis sel kanker. SIMPULAN Dari hasil data dan pembahasan pada bab- bab sebelumnya, maka dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut :
Senyawa turunan 1,3 dibenzoil tiourea secara in silico mampu berinteraksi dengan Check point kinase 1 dan beberapa senyawa memiliki energi ikatan yang lebih rendah dari senyawa UCM (native ligand) yang berarti memiliki aktivitas lebih kuat. Residue yang sering terlibat dalam ikatan adalah Lys 132, His 128, Asn 135 dan Leu 136. Terdapat senyawa turunan yang memiliki Energi ikatan paling stabil diantara turunan 1,3- Dibenzoylthiourea senyawa tersebut adalah: 1,3 bis ({ [ 3-dimethylamino )phenyl ] carbonyl } thiourea, atau 1,3- Dibenzoylthiourea yaitu subtituen (3- N(CH3)2 dengan energi ikatan - 95,6248. DAFTAR PUSTAKA Gustia, Irna. 2010. Penyebab Kanker Orang Indonesia http://health.detik.com [Diakses tanggal, 15 Januari 2012] Kesicki et al. 2009. Urea Or Thiourea Subtituted 1,4-Pyrazine Coumpounds Useful as Anti- Cancer Agents and For Inhibiting Chk1. US patent: 7608618 Kitchen, Douglas B. 2004. Docking and Scoring In Virtual Screening For Drug Discovery: Methods And Applications Drug Discovery; 3 : 935-949 Kresno, Siti B. 2003. Ilmu Dasar Onkologi. Jakarta ; PT Quparada Makuda Perkasa. Kroemer, R. T. 2007. Structure-Based Drug Design: Docking and Scoring Current Protein and Peptide Science. 8, 312-328. Kumar, dkk. 2003. Robbins Basic Pathology 7th ed. Elsevier Inc. : New York. Kunnumakara, dkk. 2008. Cancer is A Preventable Disease That Requires Major Lifestyle Changes. Pharm. Res. 25(9): 2097-116. Lipinski, C.A, F. Lombardo; B.W. Dominy dan P.J. Feeney.1997. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Del Rev23:3 25. Meuth, M..2010. Chk1 suppressed cell death. Cell Division 5:21. Morris, G.M., Lim-Wilby, M., 2001. Molecular Docking : In Methods In Molecular Biology. MolecularModeling of Proteins. Humana Press: New Jersey. Prudhomme M.. 2006. Novel Checkpoint 1 Inhibitors. Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery. 1, 55-68. Purnomo, Hari. 2011. Kimia Komputasi Molecular Docking PLANT. Yogyakarta; Pustaka Pelajar. Siswandono, Soekarjo Bambang, editor. 2008. Kimia Medisinal, Surabaya: Airlangga University Press. p. 337-343. Prajanata, I Gde Mahendra. 2011. Uji Aktivitas Sitotoksik 3,4- Diklorobenzoiltiourea Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSTLT) [Skripsi]. Surabaya: Fakultas Farmasi UNAIR 21
22