DASAR REKAYASA GENETIKA Rekayasa = manipulasi = modifikasi= perubahan bahan genetik (perubahan & pemindahan gen) Cara: 1. Persilangan seksual (perkawinan) 2. Hibridisasi somatik 3. Mutasi 4. Teknologi DNA rekombinan (rekayasa genetika) Tujuannya sama: perbaikan genetik dari suatu sifat
PERSILANGAN SEKSUAL Kelemahan: Waktu lama, Kurang presisi Keuntungan: Mudah, murah HIBRIDISASI SOMATIK Penggabungan sel somatik (protoplast) Simetrik: kontribusi bahan genetik kedua tetua sama Asimetrik: kontribusi bahan genetik kedua tetua berbeda Kelemahan: Regenerasi sulit (tanaman) Keuntungan: Menggabungkan bahan genetik dari spesies berbeda
Pemuliaan Tanaman Konvensional (Persilangan seksual) gen yang tidak diinginkan gen yang diinginkan donor (spesies sama atau kerabat dekat) Rantai gen, seperti untaian mutiara. Pemuliaan konvensional menggabungkan banyak gen dalam sekali penyilangan. Penyilangan balik (back-cross) harus dilakukan untuk menghilangkan gen-gen yang tidak diinginkan Dikawinkan (disilangkan) varietas baru varietas komersial Dikawinkan beberapa kali (silang balik)
Hibridisasi Somatik gen yang tidak diinginkan gen yang diinginkan Rantai gen, seperti untaian mutiara. Fusi sel menggabungkan banyak gen dari 2 individu atau lebih. Penapisan yang intensif harus dilakukan untuk menghilangkan gen-gen yang tidak diinginkan dan mempertahankan fertilitas donor (spesies sama atau lain) Fusi sel varietas komersial Penapisan dan seleksi intensif varietas baru
gen yang tidak diinginkan Mutasi Fisik: radiasi UV, X, gamma, suhu Kimia: kolkisin, EMS, 5-BrU varietas baru Penapisan dan seleksi intensif Mutasi terhadap gen dapat mengubah struktur dan fungsi protein yang disandinya. Mutasi bersifat acak sehingga penapisan yang intensif terhadap mutan harus dilakukan untuk memilih individu mutan yang diinginkan
REKAYASA GENETIKA Teknologi DNA rekombinan GMO Cara: penyisipan DNA asing (transgen) kedalam genom sehingga diekspresikan, dan diwariskan Transgenesis: proses perakitan organisme transgenik Keuntungan: Presisi, cepat, gen dari berbagai organisme Kelemahan: Teknologi, mahal
Teknologi DNA rekombinan (Bioteknologi) gen yang tidak diinginkan gen yang diinginkan donor (berasal dari spesies yang sama atau lain) pemindahan gen varietas komersial Dengan teknologi DNA rekombinan, hanya satu gen saja yang dipindahkan. Pemindahan hanya terjadi pada gen yang diinginkan varietas baru
Ekspresi transgen Elemen pengontrol: promoter dan terminator organisme: eukaryot/prokaryot tujuan: kuantitas, tempat, waktu (+enhancer, intron) Promoter: tepat sasaran (waktu dan tempat) konstitutif (ekspresi terus menerus): 35S CaMV waktu dan tempat spesifik
Cara introduksi transgen kedalam sel inang Transformasi (plasmid) Transfeksi (fage, virus) sel hewan, serangga, bakteri Penanda seleksi Tujuan: untuk menapis sehingga sasaran dapat diindentifikasi dan diisolasi Reaksi biokimia sehingga terbentuk warna: X-gal (seleksi biru-putih) Reaksi resistensi terhadap antibiotika: ampisilin, kanamisin
Metode transformasi Agrobacterium tumefaciens Biolistik Mikroinjeksi Elektroporasi Transfer langsung dengan PEG Liposom
Agrobacterium: Khusus untuk tanaman tumefaciens: tumor (pti) rhizogenes: akar berambut (hairy root) (pri) Plasmid pti dari A. tumefaciens Transfer: T-DNA (12-24 kb) Gen-gen vir: pindah & integrasi Ori: replikasi Katabolisme opin
Biolistik Banyak untuk tanaman tetapi tidak banyak untuk hewan Jaringan, penggunaan luas Khimera sehingga seleksi harus ketat Tekanan udara: He Partikel (<10 μm): emas atau tungsten Pengaturan: jarak dan lama tembak
Elektroporasi Kejutan listrik: membran protoplast Bakteri, tanaman, hewan Transfer langsung Mg2+, Ca2+, PEG Heat shock Tanaman: regenerasi dari protoplast ke sel ke tanaman utuh
Mikroinjeksi Banyak untuk hewan, jarang untuk tanaman Injeksi di inti sel (kloroplast atau mitokondria) Sel hewan: injeksi di sel telur terbuahi
Transfeksi
DASAR PENGKLONAN GEN Tahapan Pengklonan Gen 1. Isolasi DNA (gen) 2. Penyisipan DNA kedalam vektor 3. Introduksi vektor (rekombinan) kedalam sel inang (bakteri)
ENZIM YANG TERLIBAT 1. Enzim restriksi endonuklease Memotong DNA pada situs spesifik Tipe II: situs pengenalan dan pemotongan spesifik Situs pengenalan: palindrom (simetri) 5 -N-N-G-G-C-C-N-N-3 3 -N-N-C-C-G-G-N-N-5 HaeIII 5 -N-N-G-G C-C-N-N-3 3 -N-N-C-C G-G-N-N-5 5 -N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-3 3 -N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-3 EcoRI 5 -N-N-G A-A-T-T-C-N-N-3 3 -N-N-C-T-T-A-A G-N-N-3 Hasil pemotongan Ditentukan oleh situs pemotongan Pusat simetri: ujung rata (blunt end) Di luar pusat simetri: ujung tidak rata/kohesif (sticky end)
Enzim restriksi Contoh Enzim Restriksi Endonuklease Organisme asal Situs pengenalan (arah 5-3 ) EcoRI Escherichia coli G AATTC kohesif BamHI Bacillus amyloliquefaciens G GATCC kohesif BglII B. globigii A GATCT kohesif PvuI Proteus vulgaris CGATCG kohesif PvuII P. vulgaris CAGCTG rata HindIII Haemophilus influenzae Rd A AGCTT kohesif HinfI H. influenzae Rf GANTC kohesif Sau3A Staphylococcus aureus GATC kohesif AluI Arthrobacter luteus AG CT rata TaqI Thermus aquaticua TCGA kohesif HaeIII H. aegyptius GG CC rata HpaII H.parainfluenzae C CGG kohesif NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC kohesif Ujung potongan yang dihasilkan
2. Enzim Ligase Untuk menyambung potongan DNA 5P dari nukleotida 1 dengan 3OH nukleotida 2 2 tipe:dna ligase dari E.coli DNA ligase dari fage T4
ISOLASI GEN 1. Pemotongan DNA dengan enzim restriksi endonuklease Pemotongan DNA Pustaka Genom
Construction of genomic library DNA total Partial digestion 7-20 kb DNA fragment Ligation λbluestar Packaging Transvection
2. Isolasi cdna cdna: DNA yang disintesis berdasarkan mrna RNA total = mrna + rrna + trna RNA total + Oligo (dt) (Oligo (dt)+ mrna) + (rrna+trna)
Pengklonan gen melalui RT-PCR mrna RT cdna PCR Ligasi Transformasi
3. Transposon Dapat berpindah tempat di kromosom Bila menyisip ke gen, gennya mengalami mutasi Mutan dapat dilacak dengan transposon sebagai pelacaknya Perlu: konstruksi pustaka genom
VEKTOR PENGKLONAN Pembawa molekul DNA 1. Plasmid Karakteristik: Replikasi (autonom) Ekstra kromosom Stabil Ukuran 1-300 kb Jenis: F (fertilitas konjugasi) R (resistensi antibiotika) Toksin (ColE1 dari E.coli) Degradatif (TOL dari Pseudomonas putida) Patogenesitas (pti dari A. tumefaciens)
Cloning gene by RT-PCR: pgem-t Easy (Promega) Host: E. coli DH5α Cloning vector & host
Keadaan plasmid di dalam bakteri: Non-integratif (tidak menyisip di kromosom inang) Episom (menyisip di kromosom inang) Syarat menjadi vektor: Ukuran kecil Punya situs penyisipan Gen penanda seleksi
2. Fage Virus yang menyerang bakteri Fage λ Bentuk: kepala dan ekor Siklus hidup: (1) lisis, (2) lisogeni Ukuran genom: 49 kb, utas ganda Kedua ujung: situs cos (1) sirkuler, (2) situs pemotongan
Fage M13 Bentuk: batang/filamen Ukuran genom: 6,407 kb, linier Perbanyakan: tanpa lisis sel inang
Cloning vector & host E. coli strain ER1647 Host:, BM25.8, DH5α
3. Cosmid DNA hibrid: λ dan plasmid Ukuran: 5 kb sehingga dapat membawa 40 kb DNA Dapat digunakan sebagai vektor dengan karakteristik: Mempunyai titik asal replikasi Mempunyai situs cos Mempunyai gen penanda seleksi
4. Kromosom buatan dari khamir (Yeast Artificial Chromosome = YAC) Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar Konstruksi pustaka genom Karakteristik sebagai vektor: Mempunyai sentromer Mempunyai telomer (menghindari ligasi dengan kromosom lainnya) Mempunyai titik asal replikasi
5. Kromosom buatan dari bakteri (Bacterial Artificial Chromosome = BAC) Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar Konstruksi pustaka genom