REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN VIRUS

Transkripsi

1 REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN VIRUS Fage/virus memanfaatkan perangkat sel inang untuk sintesis DNA/protein Strategi memanfaatkan sel inang mensintesis 4 makromolekul: 1. RNA polimerase baru khusus mentranskripsi kromosom virus 2. Subunit RNA pol baru berasosiasi dengan polimerase sel inang, hanya mentranskripsi kromosom virus 3. Protein represor menghambat fungsi sel inang 4. Protein aktivator mengatur ekspresi gen virus

2 Regulasi pada fage T7 2 kategori gen: Gen awal (early genes): Klas I diekspresikan pertama Gen lambat (late genes): Klas II dan Klas III diekspresikan bila produk gen awal tersedia

3 Regulasi pada fage T7 3 kelompok gen 1.Produk gen awal menghambat sintesis RNA inang 2.Produk gen metabolisme DNA (enzim untuk replikasi kromosom virus & nuklease untuk degradasi kromosom sel inang nt bebas) 3.Produk gen akhir (mantel, ekor & protein pembungkus kromosom virus). Produk terakhir: lisozim lisis sel inang fage

4 Ekspresi T7 1.Gen-genklasI diekspresikanolehrna polselinang transkrip panjang dipotong oleh RNaseIII dari sel inang 5 mol mrna translasi oleh ribosom dari sel inang Produk: antirestriksi (0.3) melindungi kromosom virus dari degradasi oleh enzim restriksi sel inang protein kinase (0.7) modifikasi RNA pol sel inang, membatasi ekspresi gen klas I dan menjamin ekspresi gen klas II dan III RNA polimerase T7 (1) transkripsi klas II dan III (80% genom virus T7) Ligase (1.3) menyambung fragmen DNA 2. Gen-gen klas II diekspresikan oleh RNA pol T7 -replikasi DNA virus 3. Gen-gen klas III -morfogenesis fage, pengemasan DNA, lisis sel inang

5 Siklus fage T7

6 Regulasi pada SPO1 SPO1: virus besar, menginfeksi Bacillus subtilis 3 kelompok gen: early, middle, late 1. Gen awal RNA pol sel inang (menghasilkan produk gen 28) 2. Gen tengah RNA pol sel Inang yang mengandung produk gen 28 pada posisi faktor σ Faktor σ mengenali 35: TTGACA dan -10: TATAAT pada gen awal SPO1 Produk gen 28 mengenali 35: AGGAGA dan -10: TTTTTT pada gen tengah SPO1 Menghasilkan produk gen 33 dan Gen akhir RNA pol sel inang yang mengandung produk gen 33 dan 34

7 Regulasi pada SPO1 (lanjutan) Transisi ekspresi gen awal ke gen tengah dan dari gen tengah ke gen akhir melibatkan modifikasi RNA polimerase (melalui penggantian salah satu subunitnya, yaitu posisi faktor σ)

8 Regulasi pada λ Setelah menginfeksi E.coli, λ menempuh: 1.Siklus litik sel inang lisis 100 fage 2.Siklus lisogenik kromosom fage menyisip kedalam kromosom E.coli

9 Siklus litik atau lisogenik? Protein-protein regulator yang disandi λ

10 Regulasi selama siklus litik λ Fase litik meliputi 3 fase: Fase Immediate-early Fase Delayed-early Fase Late Fase Immediate-early Kromosom λ masuk, transkripsi oleh RNA pol sel inang. Inisiasi transkripsi dimulai dari P R (transkripsi ke kanan) gen cro dan P L (transkripsi ke kiri) gen N. Protein N diperlukan untuk transisi dari immediate-early ke delayed early (seperti produk gen 28 pada SPO1)

11 Regulasi selama siklus litik λ Fase Delayed-early Dimulai saat protein N menstimulasi transkripsi gen-gen delayed- early, mengekspresikan gen cii dan ciii (relevan untuk siklus lisogenik), gen O, P (untuk replikasi kromosom λ) dan Q (untuk transisi dari delayed-early ke late, seperti produk gen 33 dan 34 dari SPO1) Fase Late Dimulai saat protein Q menstimulasi transkripsi gen-gen late spt gen penyandi kepala, ekor dan faktor-faktor litik

12 Transkripsi gen-gen immediate-early RNA polimerase sel inang: Kanan: P R cro Kiri: P L N

13 Transkripsi delayed-early RNA polimerase sel inang (faktor δ diganti protein N) Kanan: P R cii, O, P, Q Kiri: P L CIII

14 Keadaan lisogeni Siklus lisogeni memerlukan: 1. Protein represor λ menghambat ekspresi gen-gen untuk siklus lisis Disandi oleh gen ci di bawah kontrol P RE (promoter for repressor establishment) 2. Protein Int λ integrasi ke kromosom E. coli Disandi oleh gen Int di bawah promoter P INT 3. P RE dan P INT : sekuensi mirip, memerlukan protein cii dan ciii supaya RNA polimerase mengenalinya cii dan ciii diperlukan untuk siklus lisogeni

15 Keadaan lisogeni

16 Protein cii dan ciii Protein cii protein regulator (aktivator) seperti CAP mengikat daerah 35 dari P RE dan P INT menstimulasi RNA pol menempel pada promoter sehingga kedua operon ditranskripsikan Protein ciii menonaktifkan protease yang dapat mendegradasi protein cii ( menjaga stabilitas cii) CII dan ciii memerlukan protein N

17 Mekanisme Lisogeni Represorλ mengikat operator (O L dan O R ), mencegah transkripsi gen-gen yang dikontrol P R dan P L yaitu: gen N dan cro N dan CRO tidak stabil konsentrasi di dalam sel turun (rendah) N rendah menghambat transkripsi gen-gen delayedearly yang tergantung N, yaitu: O, P, Q Q rendah/tidak ada mencegah ekspresi gen-gen dan late tidak terjadi siklus lisis Protein Int perantara rekombinasi situs spesifik antara attp dan attb sehingga kromosom λ terintegrasi kedalam kromosom E. coli

18 Strategi λ dalam memilih siklus 1. Menghasilkan protein-protein N dan Q, yang berinteraksi dengan RNA pol dan mempengaruhi pembacaan terminator lisis 2. Menghasilkan protein aktivator cii yang mengikat daerah promoter dan memudahkan RNA pol menempel pada promoter lisogeni 3. Menghasilkan represor mengikat operator lisogeni

19 Interaksi represor-operator Mutasi gen ci plak jernih (WT plak keruh: lisis & lisogeni) Mutasi cii- dan ciii- plak jernih Represor: stabil, 26 kda, berinteraksi dengan operator sebagai dimer Mutan operator (O L- dan O R- ) virulen (represor normal tapi tidak dapat mengikat operator tidak dapat menempuh siklus lisogeni plak jernih (~laco c )

20 Operator Operator mempunyai 3 situs penempelan (O L 1, 2, 3; O R 1, 2, 3) Operator tumpang tindih dengan promoter Setiap situs penempelan = 17 nt, dipisahkan dengan yang lain oleh daerah kaya AT Setiap mutasi pada situs penempelan virulen = mutasi virulen

21 Lisis-Lisogeni Lisis/lisogeni ditentukan oleh 6 protein regulator yang berkompetisi, yaitu: N, Q, cii, ciii, ci, dan cro Protein cro (control of repressor and other things) paling menentukan terjadinya siklus lisis atau lisogeni diekspresikan segera setelah infeksi λ tidak memerlukan protein N ada sebelum produk ci (represor), cii dan ciii ada di dalam sel represor, dapat mengikat O R dan O L seperti represor ci (tapi kurang efisien dan kurang stabil) tidak dapat menghambat secara penuh ekspresi gen-gen N dan ciii (dibawah P L ) dan cro, cii, O, P, dan Q (di bawah P R )

22 Mekanisme Lisis-Lisogeni Lisogeni memerlukan ekspresi gen ci perlu cii dan ciii untuk mengaktifkan P RE Lisis memerlukan ekspresi seluruh gen perlu antiterminator N dan Q Transkripsi ci lebih sensitif terhadap penurunan cii/ciii daripada transkripsi untuk gen-gen yang terlibat dalam siklus lisis terhadap penurunan N dan Q jika cro banyak menempel pada O R dan O L cii dan ciii rendah ci tidak diekspresikan ekspresi seluruh gen λ siklus lisis jika cro sedikit tidak kuat menempel pada O R dan O L ekspresi cii dan ciii normal ci diekspresikan siklus lisogeni tingkat produksi cro temperatur, keadaan metabolit sel inang, genotipe sel inang, genotipe fage

23 Keadaan E. coli lisogeni Bakteri lisogenik untuk λ (E. coli (λ)) kebal terhadap superinfeksi (+λ) E. coli (λ) + λ DNA λ masuk tapi tidak terjadi lisis pada bakteri Profage mensintesis represor ci pada tingkat rendah menempel pada P R O R dan P L O L pada profage (menjaga kondisi lisogeni) dan P R O R dan P L O L pada λ yang masuk (mencegah replikasi dan integrasi kedalam kromosom E. coli krnsitusattbsudahditempati) kromosom λ berada di sitosol jumlahnya berkurang (hilang) bila E. coli mengalami pembelahan sel

24 Transkripsi represor pada tingkat rendah di E. coli (λ) dikontrol oleh P RM (promoter for repressor maintenance) yang tidak memerlukan cii dan ciii (beda dengan P RE ) Transkripsi dari PRM dikontrol oleh protein ci: Jika represor ci rendah P RM dirangsang transkripsi ci Jika represor ci tinggi transkripsi dari P RM dihambat oleh represor ci ( regulasi autogenous)

25 Induksi lisis dari keadaan profage Lisis terjadi karena protein represor ci tidak dapat menghambat ekspresi operon dari profage λ Kehilangan secara spontan profage λ dari kromosom E. coli jarang terjadi

26 1. Induksi zigotik Sel donor lisogenik Hfr x sel resipien non lisogenik Jika kromosom yang mengandung profage masuk ke sel resipien tidak menemui protein represor transkripsi dari P R O R dan P L O L siklus lisis Tidak terjadi lisis jika sel resipien adalah E. coli (λ)

27 2. Mutasi pada ci Mutan ci857 sintesis protein represor thermolabil (stabil pada 30 o C, tidak aktif pada 42 o C) E. coli (ci857) dipanaskan E. coli lisis

28 3. Perlakuan bakteri lisogenik yang dapat merusak DNA (dengan irradiasi UV, mitomisin, sinar X) Mekanisme: perbaikan DNA dengan sistem SOS Bila DNA rusak dan tidak dapat diperbaiki dengan replikasi, E. coli mensintesis protein RecA memudahkan sintesis enzim SOS termasuk untuk replikasi tanpa DNA cetakan. RecA adalah protease yang dapat merusak represor LexA (menekan enzim sistem perbaikan kesalahan), dan represor λ dalam E. coli (λ). Jika DNA rusak sinyal untuk mensintesis protein RecA merusak represor λ profage terinduksi untuk mengalami lisis

29 Regulasi SV40 Produk gen early Antigen t (15kD) Antigen T (96 kd) Transkrip sama, beda splicing Arah transkripsi gen-gen early berbeda dengan gen-gen late Produk gen late Protein kapsid (VP1, VP2, VP3) beda splicing mrna late splicing: 16S mrna VP1 19S mrna: VP2 VP3 Krn 2 kodon AUG

30 Regulasi sintesis protein SV40 Infeksi (8-10 jam) gen early (gen A penyandi antigen T) ditranskripsikan oleh RNA pol dan ditranslasikan oleh ribosom sel inang Mutan tsa (antigen T thermolabile) tidak dapat memulai replikasi kromosom virus & tidak dapat memulai transkripsi gen-gen late untuk protein kapsid virus Antigen T protein pengatur early yang esensial (~ protein N pada λ)

31 Mekanisme Promoter early (EI dan EII) dekat dengan ORI dan gen early A Situs penempelan antigen T (I, II, III) bebas transkripsi oleh RNA pol dari EI Melekatnya antigen T (tetramer) pada situs I Inisiasi transkripsi dari situs EII Penempelan antigen T pada situs II transkripsi gen A berhenti ekspresi gen-gen late

32 Regulasi SV40 Kromosom SV40 menginfeksi sel inang: RNA pol memilih promoter EI untuk memulai transkripsi gena sintesis antigen T Akumulasi antigen T (tetramer) mengikat situs I inisiasi transkripsi dari EI dihambat, sehingga RNA pol menempel pada promoter EII untuk melakukan transkripsi antigen T jumlah antigen T banyak mengikat semua situs I, dan II transkripsi gen early berhenti, dan replikasi DNA SV40 dan transkripsi gen-gen late dimulai

33 Kenapa terjadi early/late? Promoter EI dan EII jauh lebih kuat daripada promoter pada gen-gen late sehingga transkripsi oleh RNA pol pada gen A sangat intensif produk antigen T banyak Antigen T menghambat ekspresi gen-gen early, sehingga RNA pol memulai ekspresi gen-gen late Sintesis antigen T regulasi autogenous (~ represor λ ~ trp) Mutan tsa antigen T thermolabile didegradasi (situs I dan II bebas) stimulasi 15x transkripsi gen early overproduksi protein mutan T