BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimen karena observasi yang dilakukan dibawah kondisi buatan yang kondisinya dibuat dan diatur. Objek penelitian ini adalah patogenisitas jamur C. gloeosporioides terhadap tanaman cabai merah yang diberi perlakuan berbagai konsentrasi ekstrak rimpang kunyit (C. domestica Val.), DMSO 1% (kontrol negatif), akuades steril (kontrol negatif) dan Dithane M-45 0,2% (kontrol positif). B. Desain Penelitian Dalam penelitian ini digunakan desain penelitian Rancangan Acak Lengkap (RAL) karena penelitian dilakukan dalam kondisi yang relatif homogen. Hasil uji pendahuluan pada penelitian sebelumnya secara in vitro menunjukkan konsentrasi ekstrak kunyit 0,15% dapat menghambat perkecambahan spora sebesar 54,8% dengan rata-rata perkecambahan spora 3,3 x 10 5 (spora/ml) (Arhandhian, 2009). Pada penelitian ini menggunakan konsentrasi ekstrak rimpang kunyit yang dilipatgandakan dari hasil uji pendahuluan penelitian sebelumnya untuk uji fitotoksik ekstrak secara in vivo yaitu 0,1%, 0,3%, 0,6%, 0,9%, 1,2% dan 1,5%. Konsentrasi ekstrak kunyit yang digunakan pada uji hayati pokok ditentukan kemudian setelah dilakukan uji hayati pendahuluan. Untuk kontrol 20
negatif digunakan DMSO 1 % dan akuades steril, sedangkan untuk kontrol positif digunakan Dithane M-45 0,2%. Banyaknya pengulangan untuk setiap perlakuan diperoleh dari rumus pengulangan Rancangan Acak Lengkap, yaitu (t) (r) 1 > 20, dimana t adalah perlakuan (treatment) dan r adalah pengulangan (replikasi) (Gomez dan Gomez, 1995). Jadi: (t) (r) 1 20 (8) (r) 1 20 8r 1 20 8r 21 r 2,625 Dibulatkan menjadi 3 Berdasarkan perhitungan diatas maka banyaknya pengulangan yang harus dilakukan adalah paling sedikit tiga kali. Tabel 3.1 Desain Rancangan acak Lengkap C1 A2 H3 G1 C3 B2 C2 E2 A3 G2 E3 E1 D3 D1 G3 H2 H1 B1 B3 D2 F1 F3 A1 F2 Keterangan: A : kontrol negatif akuades steril E : konsentrasi ekstrak 0.2% B : kontrol positif 0.2% Dithane M-45 F : konsentrasi ekstrak 0.3% C : kontrol negatif DMSO 1% G : konsentrasi ekstrak 0.4% D : konsentrasi ekstrak 0.1% H : konsentrasi ekstrak 0.5% 21
C. Populasi dan Sampel 1. Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah seluruh biji cabai merah (Capsicum annuum L.) varietas TW. 2. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji cabai merah (Capsicum annuum L.) yang diberi perlakuan dengan ekstrak rimpang kunyit (C. domestica Val) dengan berbagai konsentrasi. D. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan April sampai dengan bulan Oktober 2010 di laboratorium mikrobiologi dan rumah kaca Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI. Jamur C. gloeosporoides Penz. yang digunakan untuk penelitian diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Sayuran (BALITSA) Lembang, Bandung. E. Alat dan Bahan Penelitian Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel 3.2 dan Tabel 3.3. Tabel 3.2 Daftar alat yang digunakan No. Nama alat Jumlah Spesifikasi 1. Alumunium foil 1 pak 25 sq.ft (7,6 m x 30 cm) 2. Autoklaf 1 buah Merek EYELE model HL36 AE 3. Blender 1 buah Merek National 4. Beaker glass @1 buah Gelas pyrex ukuran 1000 ml dan 500 ml 22
5. Botol kecil 10 buah Kapasitas 25 ml 6. Cawan petri Secukupnya Gelas pyrex 7. Gelas ukur @1 buah Pyrex kapasitas 10 ml dan 250 ml 8. Gelas Objek dan gelas penutup 4 buah 25,4 x 76,2 mm (1 1 x 3 1 ) dan 1-1,2 mm 9. Haemocytometer 1 buah 0,100 mm tiefe depth profondeur 10. Jarum inokulasi 1 buah Panjang 15 cm 11. Kain kasa Secukupnya Steril 12. Kapas Secukupnya Kapas pembalut 13. Kertas saring Secukupnya Whatman No.1 14. Labu erlenmeyer 2 buah Pyrex kapasitas 500 ml 15. Lampu spirtus 2 buah Kapasitas 200 ml 16. Magnetic stirer 1 buah Model RCH-3 17. Makropipet @1 buah Kapasitas 5 ml dan 9 ml 18. Mikroskop 1 buah 1000 x perbesaran 19. Neraca digital 1 unit Merek AND ketelitian 0,001 mg 20. Pisau 1 buah Tajam 21. Pelubang gabus 1 buah 6 mm 22. Polybag 60 buah Ukuran 20 x 35 cm 23. Rak tabung 4 buah Berbahan kayu 24. Sekop kecil 1 buah 25. Shaker 1 unit Eyela Multi Shaker MMS 26. Sprayer 1 buah 27. Tabung reaksi 50 buah Gelas pyrex 28. Vortex 1 unit Sibata Test Tube Mixe -1 23
Tabel 3.3 Daftar bahan yang digunakan No. Nama bahan Jumlah Spesifikasi 1. Agar-agar 15 gram Difco agar 2. Akudes 3 liter 3. Benih cabai merah 1 bungkus Hot Beauty (F1 Hybrid) Know-You Seed Taiwan 4. Dithane M-45 1 bungkus mengandung 80% Mancozeb 5. DMSO 2 5ml Konsentrasi 100% 6. Ethanol 1000 ml Konsentrasi 70% dan 96 % 7. HCl secukupnya Teknis 8. Jamur C. 1 stok kultur Koleksi BALITSA gloeosporiodes Penz. 9. Kunyit 5 kg Padalarang 10. Kentang Dieng 500 gram Pasar lokal 11. NaCl 5 gram Teknis 12. NaOH secukupnya Teknis 13. Sukrosa 200 gram Teknis 14. Benih cabai merah 1 bungkus Hot Beauty (F1 Hybrid) Know-You Seed Taiwan 15. Tanah steril 25 kg Tanah Lembang Disterilkan dengan autoclave 24
F. Langkah kerja 1. Tahap persiapan a. Pembuatan Medium jamur Medium yang digunakan dalam pertumbuhan jamur adalah medium PSA (Potato Sukrose Agar). Pembuatan medium PSA adalah sebagai berikut: sebanyak 200 g kentang dipotong-potong kemudian direbus dalam 1000 ml akuades. Setelah kentang empuk kemudian disaring dan didapatkan ekstrak kentang. Ekstrak dilarutkan dengan akuades hingga volumenya 1000 ml dan ditambahkan 20 g sukrosa serta 15 g agar-agar. Selanjutnya dipanaskan menggunakan magnetic stirrer with hot plate selama 20 menit. Derajat keasamannya (ph) diukur dengan menggunakan ph meter dan ditambahkan HCl 1M atau NaOH 1M sampai ph medium mencapai 5,6. Medium tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing 9 ml dan disterilisasi menggunakan autoklaf (Gandjar et al., 1999). b. Sterilsasi Semua alat gelas tahan panas dan medium yang akan digunakan disterilkan dengan autoklaf selama 15-20 menit pada suhu 121 o C dengan tekanan 1 atm. Alat-alat yang tidak tahan panas disterilkan dengan etanol 70%. 25
2. Tahap pra-penelitian a. Identifikasi jamur Identifikasi jamur C. gloeosporioides Penz. dilakukan melalui pengamatan morfologi jamur secara makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan makroskopis dilakukan dengan mengamati warna dan bentuk koloninya. Sedangkan pengamatan mikroskopis dilakukan dengan mengamati struktur konidia, bentuk spora dan hifa jamur C. gloeosporioides Penz. dengan menggunakan metode slide culture secara aseptik (Heritage et al., 1996). b. Pemeliharaan dan Penyediaan jamur Sebelum dilakukan pengujian, jamur yang akan digunakan dipindahkan terlebih dahulu ke dalam medium PSA yang baru. Adapun prosesnya sebagai berikut: biakan jamur diinokulasikan pada medium PSA dalam cawan Petri dan diinkubasikan selama 7 hari pada suhu kamar. c. Identifikasi Rimpang Kunyit Rimpang kunyit (Curcuma domestica Val.) yang akan digunakan diidentifikasi terlebih dahulu. Rimpang kunyit (Curcuma domestica Val.) diamati bentuk morfologi dan warnanya yaitu berbentuk bulat lonjong dengan daging buah berwarna kuning kecoklatan. d. Perbanyakan Kultur Jamur Perbanyakan kultur jamur dimaksudkan untuk mendapatkan kultur jamur berusia tiga hari yang akan digunakan dalam penelitian. 26
Adapun prosesnya ialah diambil potongan biakan jamur menggunakan pelubang gabus berukuran 0,06 cm pada kultur jamur dalam cawan Petri, kemudian dipindahkan ke cawan Petri baru steril yang telah berisi medium PSA menggunakan jarum inokulasi (ose). Diinkubasikan selama delapan hari pada suhu ruang. Setelah delapan hari biakan jamur diambil menggunakan pelubang gabus, kemudian dipindahkan ke medium PSA miring dalam tabung reaksi. Setelah itu, diinkubasikan selama tiga hari pada suhu ruang. e. Ekstraksi Rimpang Kunyit (Curcuma domestica Val.) Rimpang kunyit yang akan digunakan, dibersihkan dengan air keran. Kemudian dipotong-potong dan dikeringkan pada tempat yang tidak langsung terkena sinar matahari dengan cara diangin-anginkan supaya terdapat sirkulasi udara yang baik. Pengeringan ini bertujuan untuk memperoleh bahan tumbuhan yang tidak rusak. Setelah kering rimpang dihancurkan menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk halus yang siap untuk diekstraksi. Serbuk rimpang kunyit dimaserasi (direndam) dengan etanol 96% dengan perbandingan 200g/1000ml (Balbi-Pena et al., 2006: 311), kemudian diaduk dan dikocok dengan kecepatan 100 rpm minimal 24 jam. Simplisia yang telah direndam, disaring menggunakan kertas saring Whatman No.1. Selanjutnya dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator (Somchit et al., 2002). Kemudian diuapkan dengan waterbath untuk menguapkan sisa pelarut 27
etanol. Ekstrak yang sudah diuapkan pelarutnya dan berbentuk pasta disimpan pada botol gelap pada suhu 4 o C. f. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ekstrak yang diperoleh dari proses ekstraksi kemudian dilarutkan dengan pelarut DMSO (Dymethil sulfoxide) 1% untuk memperoleh konsentrasi ekstrak yang dikehendaki dalam perlakuan misalnya, pembuatan larutan ekstrak dengan konsentrasi 0,1%. Ekstrak kunyit yang berbentuk pasta ditimbang sebanyak 0,05 gram, dilarutkan dalam 50 ml DMSO 1%. Kemudian larutan yang diperoleh disimpan dalam botol bertutup dan berwarna gelap. 3. Tahap pelaksanaan a. Uji Fitotoksik dari Ekstrak Rimpang Kunyit pada Benih Cabai Merah Uji fitotoksik ini bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya efek fitotoksik ekstrak rimpang kunyit terhadap pertumbuhan tanaman cabai merah. Benih cabai merah berupa biji direndam dalam ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 0,1%, 0,3%, 0,6%, 0,9%, 1,2% dan 1,5%. Sebagai kontrol positif biji direndam dalam 0,2% Dithane M-45 dan kontrol negatif akuades steril serta DMSO 1% selama 30 menit. Biji yang telah direndam ditanam pada polybag berukuran 30x40 cm yang telah berisi tanah steril. Jumlah biji per polybag berisi lima biji. Selanjutnya dipelihara selama tiga minggu untuk melihat ada atau 28
tidaknya gejala fitotoksik pada tanaman. Gejala fitotoksik yang diamati meliputi nekrotik pada tepi, tengah dan ujung daun serta adanya warna perak (bronzing ) dan kecoklatan ( browning ) pada ujung daun (Lestari, 2009). Konsentrasi ekstrak yang sudah menunjukkan gejala fitotoksik, tidak digunakan pada uji selanjutnya yaitu uji daya hambat ekstrak terhadap jamur C. gloeosporoides secara in vivo. b. Uji Daya Hambat Ekstrak Rimpang Kunyit terhadap Jamur Colletotrichum gloeosporoides Penz. pada Benih Cabai Merah 1) Uji Hayati Pendahuluan Pengujian ini dilakukan untuk mendapatkan kisaran konsentrasi efektif ekstrak rimpang kunyit dalam menghambat pertumbuhan C. gloeosporoides Penz. yang akan digunakan pada uji hayati pokok. Konsentrasi ekstrak rimpang kunyit yang digunakan ialah 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% dan 0,5%. Tahap pertama yang dilakukan adalah membuat suspensi spora C. gloeosporoides Penz. yaitu melarutkan garam fisiologis (NaCl 0,85%) ke dalam medium PSA miring yang berisi biakan jamur berusia tiga hari dengan menggosoknya perlahan menggunakan jarum inokulasi (ose) untuk melepaskan spora. Kemudian dihomogenkan menggunakan vortex dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi kosong steril. Suspensi spora dihitung menggunakan haemocytometer hingga mencapai kerapatannya 10 6 spora/ml (Gunawan, 2005). 29
Suspensi konidia sebanyak 250 ml dicampurkan dengan 2 kg tanah steril (Taufik, 2004). Polybag yang digunakan disterilkan terlebih dahulu menggunakan larutan sodium hipoklorit selama semalam kemudian dibilas dengan akuades steril (Remadi et al., 2006). Polybag steril diisi dengan tanah steril 2/3 bagian dan tanah yang berisi inokulum sebanyak 150 gram, kemudian diinkubasikan selama 6 hari untuk memastikan spora telah berkembang. Biji cabai yang akan ditanam direndam terlebih dahulu dalam ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% dan 0,5%, DMSO 1%, akuades steril dan Dithane M-45 0,2% selama 30 menit. Biji ditanam pada polybag sebanyak lima buah per polybag. Selanjutnya dipelihara dan diamati perkecambahan dan kejadian penyakit pada benih cabai merah selama tiga minggu (Taufik, 2004). 2) Uji Hayati Pokok Berdasarkan hasil uji hayati pendahuluan, maka konsentrasi yang digunakan pada uji hayati pokok ialah 0,3%, 0,6%, 0,9%, 1,2% dan 1,5%. Sebagai kontrol positif yaitu Dithane M-45 0,2% dan kontrol negatif yaitu DMSO 1% dan akuades steril. Tahapan dalam pelaksanaan uji hayati pokok sama dengan uji hayati pendahuluan. 30
3) Isolasi dan Identifikasi Jamur C. gloeosporioides Penz. dari Tanaman yang Terinfeksi Untuk memastikan tanaman cabai merah hanya terinfeksi oleh jamur C. gloeosporioides Penz., maka dilakukan isolasi dari tanaman yang terinfeksi. Teknik isolasi yang digunakan berdasarkan metode Agrios (1997), yaitu dengan tahapan sebagai berikut: a) Tanaman yang terinfeksi direndam dalam larutan Bayclin (mengandung NaOCl 5,25%) 1% selama 2-3 menit, dipotongpotong sekitar 2-4 mm. Sampel dikeringkan menggunakan kertas saring. Kemudian direndam dalam akuades steril selama 2-3 menit. b) Potongan tanaman tersebut dimasukkan ke dalam cawan Petri steril berisi medium PSA secara aseptik. Diinkubasikan selama 4-8 hari hingga terlihat pertumbuhan miselium. Kemudian dipindahkan dalam medium PSA yang baru, diinkubasikan selama empat hari. Jamur diidentifikasi menggunakan metode slide culture. 31
4. Analisis Data Untuk menghitung persentase perkecambahan, kejadian penyakit (DI), dan kematian penyakit sebagai berikut a. Menghitung persentase perkecambahan tanaman cabai merah menggunakan rumus sebagai berikut: JP = x 100% Keterangan: JP : Jumlah perkecambahan n : Jumlah tanaman yang berkecambah N : Total tanaman b. Menghitung persentase kejadian penyakit antraknos pada tanaman cabai merah menggunakan rumus sebagai berikut (Cooke, 2003 dalam Masyahit et al, 2009): DI (kejadian penyakit) = Keterangan: DI : Persentase disease incidence/kejadian penyakit n : Jumlah tanaman yang terinfeksi N : Total tanaman c. Menghitung persentase kematian tanaman menggunakan rumus sebagai berikut: K = x 100% Keterangan: K : Persentase kematian n : Jumlah tanaman yang mati N : Total tanaman 32
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan program SPSS versi 16.0 for windows. Data di uji normalitas (kolmogorov-smirnov) dan homogenitas terlebih dahulu. Apabila uji normalitas dan homogenitas terpenuhi dilakukan uji hipotesis one-way ANOVA dan apabila tidak terpenuhi dilakukan uji non-parametrik Kruskal-Wallis untuk menguji hipotesis. Dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf 5% untuk mengetahui perbandingan nilai tengah antar perlakuan yang berpengaruh nyata. 33
G. Alur Penelitian Alur penelitian dapat dilihat pada gambar dibawah ini: Tahap persiapan a. Pembuatan medium PSA b. Sterilisasi Tahap pra penelitian a. Identifikasi jamur b. Pemeliharaan jamur c. Perbanyakan kultur jamur d. Identifikasi rimpang kunyit e. Ekstraksi rimpang kunyit f. Pembuatan konsentrasi ekstrak Tahap pelaksanaan a. Uji fitotoksik dari ekstrak rimpang kunyit pada benih cabai merah b. Uji hayati pendahuluan ekstrak rimpang kunyit terhadap jamur Colletotrichum gloeosporioides pada benih cabai merah c. Uji hayati pokok d. Isolasi jamur dari tanaman yang terinfeksi Analisis data Penarikan kesimpulan Penulisan skripsi Gambar 3.1 Bagan alir penelitian 34