BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan Proses pembuatan ekstrak dilaksanakan pada bulan Desember 2012 sampai dengan bulan Januari 2013 di Laboratorium Mikrobiologi Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjajaran. Proses pembuatan media agar dan kultur bakteri dilakukan pada bulan Januari 2013 di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjajaran. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April 2013 sampai dengan bulan Mei 2013 di Laboratorium Akuakultur Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjajaran. 3.2 Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1. Alat-alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : 1. Wadah kaca (keller) yang memiliki volume 2,5 liter sebanyak 15 buah sebagai wadah percobaan. 2. Akuarium 1,5m x 0,5m x 0,5m yang digunakan sebagai wadah stok benih udang galah. 3. Heater sebagai pengatur suhu air. 4. Termometer sebagai pengukur suhu air. 5. Selang aerasi, batu aerasi, serta katup pengatur aerasi yang digunakan untuk aerasi ke seluruh toples perlakuan. 6. Kit distilasi, maserator dan evaporator yang digunakan dalam proses pembuatan ekstrak. 7. Petridisk, Mikro pipet (100 dan 1000 µm), L-glass, Tip mikro pipet (biru dan putih), Pinset, Pembakar Bunsen (spiritus), Erlenmeyer dan Falcon tube yang digunakan untuk kultur bakteri Vibrio harveyi. 8. Autoclav untuk sterilisasi alat-alat yang akan digunakan untuk kultur bakteri. 9. Timbangan Elektronik dengan ketelitian 0,001 gram untuk menimbang. 10. Software epaprobit digunakan untuk memperoleh hasil dari uji LC 50. 1
2 3.2.2 Bahan-bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1. Tepung daun nimba sebanyak 1 kg yang diperoleh dari penjual. 2. Benih udang galah sebagai hewan uji yang berasal dari Balai Pengembangan Benih Ikan Air Payau dan Laut cabang Pamarican. 3. Isolat murni bakteri Vibrio harveyi yang diperoleh di Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau Jepara. 4. Media TSA (Triptic Soy Agar) sebagai media kultur bakteri. 5. Metanol yang digunakan sebagai pelarut dalam proses ekstraksi (maserasi). 6. Pakan komersil produksi CV. Prima yang diperoleh di BPBIAPL Pamarican. 3.3 Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari lima perlakuan dan tiga kali ulangan. Perlakuan kohabitasi benih udang yang telah diberi pakan dengan campuran ekstrak tepung daun nimba dilakukan selama 24 jam dengan pemberian campuran formulasi pakan berbeda, yaitu : A = Kontrol (tanpa pemberian ekstrak tepung nimba pada pakan) B = 30 ppm ekstrak = 30 mg ekstrak/kg pakan C = 60 ppm ekstrak = 60 mg ekstrak/kg pakan D = 90 ppm ekstrak = 90 mg ekstrak/kg pakan E = 120 ppm ekstrak = 120 mg ekstrak/kg pakan Ket : 1 ppm ekstrak = 1 mg/kg pakan Model yang digunakan dalam penelitian ini adalah model liniear (Gaspersz 1991). X ij = µ + τ i + ε ij
3 Keterangan : X ij = hasil pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = nilai rata-rata umum τ i = pengaruh perlakuan ke-i ε ij = pengaruh faktor random perlakuan ke-i dan ulangan ke-j 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Pembuatan Ekstrak Daun Nimba Melakukan proses destilasi pelarut metanol terlebih dahulu dengan menggunakan destilasi kit dengan suhu penangas 70 o C. Tepung daun nimba sebanyak satu kilogram dimaserasi dengan menggunakan pelarut metanol banyak 3x24 jam atau hingga supernatan yang dihasilkan menjadi bening. Supernatan yang dihasilkan kemudian di evaporasi dengan menggunakan evaporator dengan suhu penangas 75 o C dan dengan kecepatan rotasi 120 rpm hingga memperoleh ekstrak dalam bentuk pasta. Ekstrak yang dihasilkan dimasukan ke dalam botol kaca yang dilapisi dengan alumunium foil dan disimpan di lemari pendingin. 3.4.2 Kultur Bakteri Vibrio harveyi Melakukan kultur bakteri Vibrio harveyi menggunakan media TSA (Triptic Soya Agar) dengan suhu 32 0 C selama 24 jam (BBPBAP 2013). Setelah itu isolat murni yang sudah diperoleh dipindah ke freezer untuk menghentikan pertumbuhan dan metabolisme bakteri tersebut. 3.4.3 Pencampuran Ekstrak Dalam Pakan Pencampuran ekstrak yang dilakukan sesuai perlakuan 30, 60, 90 dan 120 mg/kg dengan cara masing-masing ekstrak yang sudah ditimbang dilarutkan dengan air. Ekstrak yang sudah larut dalam air kemudian disemprotkan pada pakan komersil dengan menggunakan botol semprot hingga rata seluruhnya. Pakan yang sudah
4 disemprot kemudian dijemur hingga kering agar tidak mudah hancur dalam air pada saat pemberian pakan. 3.4.4 Penginfeksian Benih Udang Galah dengan Vibrio harveyi Menginfeksikan atau kohabitasi benih udang galah yang telah diberi pakan berisi ekstak daun nimba dengan udang galah yang terserang bakteri Vibrio harveyi dengan perbandingan jumlah yang sama yaitu sebanyak 15 ekor udang yang terinfeksi kedalam masing-masing toples perlakuan yang berisi 15 ekor udang yang sehat. Kohabitasi dilakukan setiap hari selama 3 x 24 jam dan benih diberi pakan dengan jumlah dan dalam waktu yang sama. 3.5 Parameter yang Diamati 3.5.1 Survival Rate Rumus yang digunakan adalah : Dimana : SR = Tingkat kelangsungan hidup (%) Nt = Jumlah individu pada akhir penelitian (ekor) No = Jumlah individu pada awal penelitian (ekor) 3.5.2 Pengamatan Abnormalitas Pengamatan dilakukan untuk mengamati tingkah laku dan perubahan morfologi yang terjadi pada benih udang galah. Pengamatan dilakukan setelah benih di kohabitasi selama 24, 48 dan 72 jam. Pengamatan yang dilakukan meliputi perubahan warna tubuh, perpendaran (menyala) pada tubuh benih udang galah yang terinfeksi bakteri, nafsu makan, dan pergerakan benih.
5 3.5.3 Uji Kualitas Air Parameter kualitas air yang diukur meliputi DO, suhu, ph, kadar amonia dengan menggunakan DO meter, ph meter, termometer dengan ketelitian 0.1 o C dan amonia test kit. Pengukuran kualitas air dilakukan pada awal dan akhir pemeliharaan. 3.6 Analisis Data Untuk menguji pengaruh tingkat kelangsungan hidup dari setiap perlakuan data diuji dengan menggunakan analisis ragam uji F dengan taraf kepercayaan 95%, jika terdapat perbedaan antar perlakuan maka dilanjutkan dengan menggunaka uji jarak berganda Duncan (Gaspersz 1991).