28 BAHAN DAN METODE Ruang Lingkup Penelitian Kajian penelitian ini meliputi: (1) ketahanan hidup postlarva vaname selama tahapan aklimatisasi ke salinitas rendah, (2) perkembangan dan ketahanan hidup postlarva setelah tahapan aklimasi dengan adanya penambahan mineral pada media, serta (3) peningkatan pertumbuhan postlarva lewat pengkayaan pakan buatan selama pemeliharaan di air bersalinitas rendah. Sebagai input yang dirancang untuk perlakuan yaitu penambahan mineral kalsium (Ca 2+ ) selama aklimasi ke salinitas rendah berbeda dan salinitas 2 ppt pada penelitian tahap-1, penambahan mineral potasium (K + ) dalam media pada penelitian tahap-2, serta pemberian protein dan kalsium pakan dalam penelitian tahap-3. Seluruh kegiatan penelitian disajikan dalam Gambar 4. Setiap tahapan penelitian merupakan rangkaian saling berkaitan. Data yang diukur pada udang umur PL 20 hingga juvenil. Pengambilan data dilaksanakan selama kira-kira 6 minggu penelitian berlangsung. Hasil percobaan tahapan aklimasi salinitas pada penelitian tahap-1 merupakan bentuk keberhasilan dari proses adaptasi yang terukur dari nilai gradien osmotik, tingkat konsumsi oksigen, dan sintasan. Hasil penelitian awal dijadikan pedoman untuk penelitian tahap kedua yang berlanjut pada penelitian tahap ketiga. START SELESAI PL 10 PL 20 PL 24 Juvenil udang (4-6 minggu) 25 ppt 25 ppt 0,2,4,6 ppt 2 ppt TAHAP AKLIMATISASI LABORATORIUM TAHAP AKLIMASI SALINITAS (Penelitian 1) Perlakuan Ca 2+ Media Pada 0,2,4,6 ppt Perlakuan Ca 2+ pada 2 ppt TAHAP PEMELIHARAAN (Penelitian 2 dan 3) + K + Media + Protein & Ca 2+ Pakan Gambar 4 Skema urutan kegiatan penelitian.
29 Penelitian Tahap Pertama Waktu dan Tempat Penelitian tahap pertama dilakukan di Laboratorium Fisiologi Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Sebelumnya, dilakukan persiapan peralatan instalasi pemeliharaan dan pengadaan benih vaname. Lama penelitian sekitar 14 hari, mencakup: tahapan aklimatisasi selama 10 hari, kemudian percobaan aklimasi ke salinitas 2 ppt selama 4 hari (96 jam). Analisa selanjutnya berlangsung di beberapa tempat. Pengukuran tekanan osmotis hemolimp dan media di lakukan di Laboratorium Embriologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB. Pengambilan data respirasi di Laboratorium Fisiologi, FPIK. Sedangkan analisa kualitas air dilakukan di Laboratorium Lingkungan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Rancangan Percobaan Penelitian tahap pertama terdiri dua seri percobaan. Percobaan pertama bertujuan mengkaji pengaruh penambahan berbagai kadar kalsium pada berbagai salinitas media terhadap sintasan postlarva vaname. Rancangan yang digunakan adalah model faktorial terdiri 16 perlakuan dengan 3 ulangan dibedakan berdasarkan penurunan salinitas (0 ppt, 2 ppt, 4 ppt, 6 ppt) dengan penambahan kalsium karbonat (0 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm) dalam media pengencer air tawar. Percobaan kedua merupakan pengulangan dari percobaan pendahuluan pada salinitas akhir 2 ppt. Rancangan percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap terdiri 5 perlakuan dengan 3 ulangan. Perlakuan ditentukan berdasarkan penambahan kalsium (CaCO 3 ) dalam air tawar yang disajikan sebagai berikut : Perlakuan A : Tanpa penambahan kalsium (kadar kalsium 20 ppm) Perlakuan B : Penambahan 50 ppm kalsium (kadar kalsium 70 ppm) Perlakuan C : Penambahan 100 ppm kalsium (kadar kalsium 120 ppm) Perlakuan D : Penambahan 150 ppm kalsium (kadar kalsium 170 ppm) Perlakuan E : Media salinitas 25 ppt (kontrol)
30 Pelaksanaan Percobaan Pengkayaan Pakan Alami Pakan alami yang digunakan yaitu kista Artemia salina dari Blue Marine dengan hatching rate 80%. Wadah untuk penetasan berupa akuarium berukuran 15 15 15 cm yang telah dilengkapi aerator. Wadah ini diisi air laut bersalinitas 25 ppt sebanyak 3 liter kemudian dimasukkan kista artemia sebanyak 5 g/l air. Setelah kista menetas menjadi nauplius, dilakukan pemanenan. Peralatan yang digunakan berupa saringan plankton net (diameter 120 μm) dengan wadah lain sebagai penampung. Sebelum diberikan ke postlarva, nauplius Artemia diperkaya dengan HUFA berupa minyak ikan. Wadah yang digunakan untuk pengkayaan adalah akuarium dengan volume 5 liter. Kepadatan nauplius Artemia sekitar 300.000 individu/l. Pengkayaan dengan HUFA dilakukan selama 6 jam. Dosis pengkayaan untuk 5 liter media dibutuhkan 0,25 ml minyak ikan yang dicampur 0,12 g ragi roti, 0,005 g kuning telur, dan 50 ml air. Campuran ini dibuat emulsi dengan menggunakan blender selama 5 menit, kemudian disimpan di refrigerator. Penyediaan pakan alami dilakukan setiap hari selama tahapan aklimatisasi laboratorium dan pelaksanaan percobaan. Aklimasi Salinitas Hewan uji yang digunakan adalah postlarva vaname. Benih diambil dari balai pembenihan (hatchery) yang berasal dari pemijahan satu induk untuk meminimalkan variasi unit percobaan. Sebelum digunakan, postlarva diaklimatisasi pada kondisi laboratorium selama 10 hari dari PL 10 hingga PL 20. Stok postlarva sekitar 2000 individu dimasukkan dalam 2 wadah akuarium ukuran 60 30 40 cm yang telah diaerasi. Media pemeliharaan berupa air bersalinitas 25 ppt. Pemberian pakan alami ke benih vaname dilakukan kontinyu 4 kali per hari hingga postlarva berumur 20 hari (PL 20). Wadah pemeliharaan untuk percobaan tahap pertama dan kedua berupa akuarium kaca berukuran 30 30 40 cm. Jumlah wadah pada percobaan tahap pertama sekitar 58 unit, sedangkan tahap kedua sekitar 12 unit. Konstruksi wadah
31 Tc Td Y 1.1 Y 3.3 Y 4.1 Y 3.1 Y 2.3 Y 4.2 Pa Ta Tb Y 3.2 Y 2.2 Y 1.2 Y 4.3 Y 1.3 Y 2.1 OP Po Y1.1 Y4.3 : Wadah perlakuan 1 sampai 4 Ta - Td : Tandon air perlakuan kalsium (0,50,100,150 ppm) Pa : Pipa-pipa penyalur air tawar Po : Pipa penyalur oksigen OP : Pompa oksigen Gambar 5 Skema pengaturan wadah pada percobaan ke-2 dalam penelitian tahap pertama melalui tampak atas. wadah dilengkapi dengan sistem pengatur salinitas, thermometer, dan aerator. Sebelum digunakan, seluruh wadah dicuci dengan deterjen, selanjutnya disucihama dengan metilen blue dan kaporit. Wadah kemudian ditempatkan di atas meja beton dan diatur secara acak sesuai satuan percobaan. Di samping wadah-wadah percobaan, juga dipasang 4 unit wadah tempat air tawar (media perlakuan) yang ditempatkan lebih tinggi untuk memudahkan dalam mengalirkan air tawar ke setiap wadah perlakuan. Untuk menjaga kestabilan suhu media maka ruangan kultur dilengkapi penerangan lampu. Skema pengaturan wadah perlakuan ditampilkan pada Gambar 5. Media pemeliharaan yaitu air laut yang berasal dari perairan pantai Ancol Jakarta. Sebelum digunakan, air diendapkan selama kira-kira 7 hari dalam bak penampung dengan diaerasi. Media air laut bersalinitas sekitar 30 ppt kemudian diencerkan menjadi salinitas 25 ppt. Teknik pengenceran salinitas menggunakan rumus : Va x Na = V 1 x N 1 V a N a V 1 N 1 = Volume akhir yang dikehendaki (l) = Salinitas akhir yang dikehendaki (ppt) = Volume air laut yang diencerkan (l) = Tingkat salinitas air laut yang diencerkan (ppt)
32 Media perlakuan yang berbeda kandungan kalsium dibuat dari pengenceran larutan kalsium yang bersumber dari kapur pertanian (CaCO 3 ). Bahan kapur ini ditambahkan ke dalam air dengan volume tertentu sehingga didapatkan larutan baku berkalsium tinggi. Selanjutnya kandungan kalsium (kesadahan kalsium) ditentukan dengan metode titrasi (Hariyadi et al. 1992). Pengadaan media perlakuan yang berbeda kadar kalsiumnya (0, 50, 100, 150 ppm) didasarkan pada metode pengenceran dengan rumusan berikut: N A.V A = N 1.V 1. + N 2.V 2. +... + N n.v n. N A = konsentrasi kalsium akhir (ppm) V A = volume larutan kalsium akhir (l) N 1 = konsentrasi baku (ppm) V 1 = volume larutan kalsium baku (l) N 2 = konsentrasi larutan kalsium 2 (ppm) V 2 = volume larutan 2 (l) N n = konsentrasi larutan ke-n (ppm) V n = volume larutan ke-n (l). Pada percobaan pertama, sekitar 50 individu postlarva umur 20 hari (PL 20) dimasukkan ke dalam wadah-wadah percobaan akuarium ukuran 30 30 40 cm. Total perlakuan adalah 16 dengan 3 ulangan. Penurunan salinitas dilakukan dengan cara menambahkan media air tawar yang mengandung kalsium. Setiap wadah diisi air bersalinitas 25 ppt sekitar 2,7 liter yang selanjutnya diturunkan secara gradual hingga salinitas perlakuan akhir 0 ppt, 2 ppt, 4 ppt, dan 6 ppt. Debit air tawar diatur sehingga lama penurunan salinitas sama pada semua wadah perlakuan. Selama tahapan aklimasi ke salinitas rendah, pakan Artemia diberikan secara at libitum dengan jumlah sekitar 300 ind/pl. Frekuensi pemberian pakan 4 kali dalam sehari, dilakukan pada pagi (pukul 07.00), siang (pukul 12.00), sore (pukul 17.00), dan malam hari (pukul 20.00). Urutan kegiatan dalam seri percobaan kedua seperti yang dilakukan sebelumnya. Udang berumur 20 hari (PL 20) secara bertahap diaklimasikan selama 4 hari. Penurunan salinitas dengan cara menambahkan media air tawar yang mengandung kalsium berbeda. Sekitar 80% media dari tiap wadah
33 ditambahkan setiap hari melalui penetesan hingga hari ke-4 mencapai salinitas 2 ppt. Selama penelitian, pengelolaan media air dilakukan secara seksama agar kualitas air tetap terjaga dengan baik. Kualitas air media dipertahankan pada keadaan yang mendukung sintasan postlarva melalui pengaturan suhu, salinitas, serta aerasi. Suhu media dimonitor tiap hari dengan tetap pada kisaran 27-29 0 C. Penurunan salinitas diatur sehingga lamanya sama pada seluruh perlakuan. Demikian juga kadar oksigen, pengaturan melalui sistem aerasi dilakukan secara kontinyu setiap hari. Pengambilan Data Jumlah udang hidup dihitung setiap hari untuk menentukan sintasan postlarva. Banyaknya postlarva dapat bertahan hidup dimonitor secara kontinyu selama periode 4 hari penurunan salinitas. Di akhir percobaan bersamaan dengan pengambilan data sintasan, dilakukan pengukuran kualitas air tiap perlakuan. Perlakuan kalsium optimum digunakan untuk penelitian selanjutnya. Selain pengambilan data sintasan tiap hari, kegiatan lain pada percobaan kedua yaitu pengambilan data osmolaritas dan tingkat konsumsi oksigen. Gradien osmotik merupakan selisih dari osmolaritas cairan tubuh dan osmolaritas media. Gradien osmotik dan tingkat konsumsi oksigen ditentukan pada hari ke-4. Osmolaritas cairan tubuh dan osmolaritas media diukur secara bersamaan. Sekitar 10 individu dari tiap unit perlakuan dipisahkan, kemudian digerus dalam tabung ependorf. Selanjutnya jaringan tubuh udang disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm. Bagian supernatan (cairan tubuh) dipisahkan sebanyak 50 µl, sedangkan sampel media diambil sebanyak 10 ml dari setiap wadah. Pengukuran osmolaritas menggunakan peralatan osmometer (OSMOMAT 030, Gonotec) yang secara prosedural disajikan pada Lampiran 1. Pengukuran tingkat konsumsi oksigen dilakukan pada keadaan standar (basal) untuk menentukan tingkat metabolisme udang selama mengalami stres aklimasi salinitas. Data dari seluruh perlakuan diambil saat hari ke-4. Sebanyak 10 individu postlarva tiap perlakuan dan salinitas normal (25 ppt) dipisahkan secara acak kemudian ditempatkan pada wadah akuarium kecil berukuran
34 15 15 15 cm yang berisi media perlakuan. Selanjutnya hewan uji dipuasakan selama 24 jam. Postlarva dimasukkan ke dalam wadah berisi 200 ml media perlakuan yang diberi penutup stirofom dan diaerasi penuh. Setelah mencapai jenuh oksigen, aerasi dihentikan. Pengukuran penurunan kandungan DO dalam media dilakukan saat awal (0 menit) dan 60 menit kemudian. Peralatan yang digunakan adalah DO-meter. Selanjutnya, untuk melihat besarnya energi yang dibutuhkan untuk aktivitas metabolisme standar (basal), data tingkat konsumsi oksigen dikonversikan ke pembelanjaan energi pada metabolisme basal (EB) menurut perumusan Brett dan Groves (1979). Parameter kualitas air yang diukur selama penelitian tahap pertama meliputi salinitas, suhu, ph, oksigen, kesadahan, amoniak, dan nitrit. Pengukuran suhu, salinitas, dan DO dilakukan secara in situ setiap hari. Sedangkan kandungan ph, alkalinitas, kesadahan, amoniak, dan nitrit diukur secara kimiawi yaitu saat awal dan akhir percobaan. Analisis Data Variabel yang diamati untuk respon metabolisme dan osmoregulasi adalah sebagai berikut : 1. Gradien Osmotik (Lignot et al. 2000) GO = Osmolaritas hemolimp udang (mosm/l H 2 O) - Osmolaritas media (mosm /l H 2 O) 2. Tingkat Konsumsi Oksigen (Liao & Huang 1975) OC = OC V DO to DO tt W V (DO to - DO tt ) W t = tingkat konsumsi oksigen (mgo 2 /g. jam) = volume air dalam wadah (l) = konsentrasi oksigen terlarut awal pengamatan (mg/l) = konsentrasi oksigen terlarut pada waktu t (mg/l) = bobot udang uji (g)
35 T = periode pengamatan (jam) 3. Sintasan Postlarva (Effendie 2002) S (%) = (N t /N o ) 100 S = persentase udang uji yang hidup (%) N t N o = jumlah individu udang uji pada akhir penelitian (individu) = jumlah individu udang uji pada awal penelitian (individu) Untuk mengevaluasi pengaruh penambahan kalsium, keseluruhan data nilai tengah gradien osmotik, tingkat konsumsi oksigen, pembelanjaan energi pada metabolisme basal, dan sintasan diolah secara statistik dengan paket program SPSS (SPSS 15.00 for Windows, SPSS Inc, USA) dan Excel 2007 for Windows. Data dianalisis lanjut dengan uji Tukey dengan tujuan mengetahui perbedaan diantara nilai tengah variabel (Steel & Torrie 1991). Sedangkan data osmolaritas cairan tubuh, osmolaritas media, dan kualitas air diinterpretasikan dalam bentuk tabel. Penelitian Tahap Kedua Waktu dan Tempat Penelitian tahap kedua bertujuan menentukan kadar potasium optimal bagi kandungan potasium tubuh, gradien osmotik, tingkat konsumsi oksigen, sintasan, laju pertumbuhan bobot rerata harian, dan efisiensi pemanfaatan pakan. Tempat pelaksanaan di Laboratorium Fisiologi, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Pengukuran kandungan potasium tubuh dilaksanakan di Laboratorium Nutrisi Hewan Perah, Fakultas Peternakan, IPB. Sedangkan pengukuran tekanan osmotis dilakukan di Laboratorium Embriologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB. Keseluruhan kegiatan penelitian yang dimulai dari pengadaan postlarva, aklimatisasi laboratorium, aklimasi ke salinitas rendah, dan tahap pemeliharaan berlangsung sekitar 57 hari. Percobaan dengan pengambilan data dilaksanakan selama 42 hari (6 minggu).
36 Rancangan Percobaan Metode yang digunakan adalah metode eksperimental dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap. Percobaan terdiri atas 4 perlakuan dengan 3 ulangan berdasarkan penambahan potasium karbonat (K 2 CO 3 ) dalam media pemeliharaan. Penentuan perlakuan yang diterapkan dalam penelitian tahap kedua adalah sebagai berikut : Perlakuan A : Tanpa penambahan K 2 CO 3 / kontrol Perlakuan B : Penambahan 30 ppm K 2 CO 3 Perlakuan C : Penambahan 60 ppm K 2 CO 3 Perlakuan D : Penambahan 90 ppm K 2 CO 3 Pelaksanaan Percobaan Aklimatisasi dan Pemeliharaan Wadah percobaan berupa akuarium kaca berjumlah 12 unit dengan ukuran 60 40 30 cm. Seluruh wadah dibersihkan dengan menggunakan kaporit. Selanjutnya wadah diatur secara acak menurut perlakuan. Untuk kebutuhan oksigen, setiap unit akuarium diaerasi dari aerator induk, serta dilengkapi pengukur suhu (thermometer). Gambaran penempatan wadah percobaan secara lebih jelas disajikan pada Gambar 6. Media perlakuan potasium dibuat terpisah-pisah dari pengenceran air laut. Sumber air tawar berasal dari air tanah yang telah diendapkan di laboratorium, sedangkan air laut berasal dari pantai Ancol, Jakarta yang didapatkan dari tempat penjualan komersil. Pengadaan media perlakuan diawali dengan pengenceran air laut bersalinitas 30 ppt menjadi 2 ppt. Selanjutnya, air dimasukkan ke 4 buah wadah (bak) masing-masing sebanyak 1000 liter. Bahan potasium karbonat (K 2 CO 3 ) ditambahkan sebanyak 0 g, 30 g, 60 g, dan 90 g ke dalam media. Dari setiap wadah, kemudian diambil sampel sebanyak 100 ml untuk pengukuran kadar potasium terlarut. Konsentrasi potasium perlakuan diukur dengan peralatan Atomic Absorption Spectrofotometer (AAS, Shimadzu AA-680). Setelah diketahui konsentrasi perlakuan, media dimasukkan ke dalam akuarium dengan volume sekitar 45 liter per akuarium. Hewan uji yang digunakan melalui tahapan aklimasi dengan perlakuan
37 Gambar 6 Tata letak penempatan wadah penelitian tahap ke-2. terbaik penelitian tahap-1. Postlarva sebelumnya diaklimatisasi dalam kondisi laboratorium selama 10 hari. Saat berumur sekitar 20 hari (PL 20), postlarva diaklimasi ke salinitas 2 ppt selama 4 hari. Media air tawar yang digunakan mengandung kalsium sekitar 70 ppm yang merupakan kadar optimal penelitian tahap pertama. Wadah akuarium berukuran 60 30 40 cm sebanyak 5 unit diisi media air laut 25 ppt sekitar 5,4 liter perakuarium. Selanjutnya, setiap wadah dimasukkan PL 20 sebanyak 400 individu. Selama tahapan aklimasi berlangsung, pakan alami Artemia yang diperkaya minyak ikan diberikan secara kontinyu sebanyak 4 kali perhari. Postlarva (PL 24) kemudian diberi campuran pakan alami dan pakan buatan (pelet). Menjelang percobaan, benih (PL 27) diseleksi dan ditimbang agar seragam digunakan sebagai hewan uji. Bobot awal rata-rata adalah 0,0382 g/individu. Setiap akuarium selanjutnya diisi postlarva berjumlah 10 individu. Pakan yang digunakan dalam penelitian tahap kedua berupa pakan buatan/pelet berbentuk crumble dengan kandungan protein sekitar 40% (Chuen shin, PT. Grobest Indomakmur). Sebelum digunakan, pakan diukur komposisi bahan penyusun dengan analisa proksimat. Jumlah pakan yang diberikan sekitar 8% dari bobot tubuh udang dengan frekuensi pemberian 4 kali
38 perhari. Sisa pakan yang tertinggal di dasar wadah dikumpulkan, dan pada akhir penelitian dikeringkan dan dihitung sebagai pakan tak terkonsumsi. Selama penelitian berlangsung, kualitas air media dijaga agar mendukung udang tetap hidup. Pengecekan kualitas air dilakukan dengan mempertahankan kisaran suhu air, oksigen terlarut, ph, serta amoniak pada kisaran ideal untuk pemeliharaan. Pergantian air dilakukan setiap hari sebanyak 20% dengan air media pengganti yang telah dipersiapkan sebelumnya. Penyiponan feses dan sisasisa pakan dilakukan pada sore hari sebelum pemberian pakan. Pengambilan Data Selain pengamatan sintasan, dalam penelitian tahap kedua dilakukan pengukuran bobot basah untuk menentukan pertumbuhan serta efisiensi pemanfaatan pakan. Kegiatan ini dilaksanakan pada hari pertama dan dilanjutkan setiap 7 hari selama 42 hari percobaan. Postlarva vaname ditimbang perpopulasi pada masing-masing wadah, kemudian dihitung rata-rata bobot individu. Data bobot pada awal dan akhir merupakan dasar penentuan laju pertumbuhan harian. Peralatan yang digunakan adalah timbangan elektrik dengan tingkat ketelitian 3 digit di belakang koma. Gradien osmotik dari tiap perlakuan potasium ditentukan dengan mengikuti prosedur yang dikemukakan dalam penelitian tahap pertama. Pengukuran osmolaritas dilakukan pada akhir penelitian. Sekitar 50 μl sampel cairan diambil dari 2 individu setiap unit percobaan, sedangkan jumlah sampel media sebanyak 10 ml. Sampel hemolimp dan air media kemudian dianalisis menggunakan osmometer (SOP OSMOMAT 030). Pengaruh perlakuan potasium media diukur secara kuantitatif berdasarkan konsentrasi potasium tubuh udang. Pengukuran dilakukan di akhir percobaan dengan menggunakan udang yang tidak sedang ganti kulit. Dari setiap wadah percobaan, diisolasi sekitar 3-4 individu, kemudian dilanjutkan preparasi sampel (Lampiran 2). Peralatan yang digunakan untuk pengukuran adalah AAS (Shimadzu AA-680). Prosedur pengukuran kandungan potasium tubuh disajikan pada Lampiran 3.
39 Data penunjang untuk melihat laju metabolisme didasarkan pengukuran tingkat konsumsi oksigen pada keadaan standar (basal) yang kemudian dikonversikan ke pembelanjaan energi pada metabolisme basal (EB). Prosedur pengukuran seperti pada penelitian tahap pertama. Sekitar 5 individu udang dalam masing-masing wadah percobaan dipuasakan selama 24 jam. Kemudian, kelompok udang ini dimasukkan dalam wadah stoples yang diisi media 0,5 liter dan sebelumnya telah diaerasi. Pengukuran DO media dilakukan saat awal (0 menit) dan 60 menit kemudian dengan menggunakan peralatan DO-meter. Setelah pengukuran, seluruh udang ditimbang untuk mendapatkan bobot total perunit perlakuan sebagai dasar dalam penentuan tingkat konsumsi oksigen. Pengukuran parameter kualitas air dilakukan pada beberapa periode waktu berbeda. Pengukuran suhu, salinitas, dan kandungan gas oksigen dilakukan setiap hari. Sedangkan ph, kesadahan, amoniak, dan kandungan nitrit diukur pada awal dan akhir penelitian. Dari setiap wadah diambil sekitar 100 ml untuk pengukuran ph dan amoniak. Analisis Data Untuk mengkaji pengaruh perlakuan potasium dalam media, beberapa variabel yang diukur selama penelitian tahap kedua adalah sebagai berikut : 1. Kandungan potasium (K + ) Kandungan potasium (mg/g) ditentukan dari pengukuran sampel seluruh tubuh udang tiap perlakuan (Davis et al. 1992). 2. Gradien Osmotik (Lignot et al. 2000) GO = Osmolaritas hemolimp udang (mosm /l H 2 O ) - Osmolaritas media (mosm /l H 2 O) 3. Tingkat Konsumsi Oksigen (Liao & Huang 1975) OC = V (DO to - DO tt ) W t OC = tingkat konsumsi oksigen (mgo 2 /g. jam)
40 V DO to DO tt W T = volume air dalam wadah (l) = konsentrasi oksigen terlarut awal pengamatan (mg/l) = konsentrasi oksigen terlarut pada waktu t (mg/l) = bobot udang uji (g) = periode pengamatan (jam) 4. Sintasan Postlarva (Effendie 2002) S (%) = (N t / N o ) 100 S = persentase udang uji yang hidup (%) N t N o = jumlah individu udang uji pada akhir penelitian (individu) = jumlah individu udang uji pada awal penelitian (individu) 5. Laju Pertumbuhan Bobot Rerata Harian (Huisman 1976) LPRH (%) = t W t - 1 100 W o LPRH = laju pertumbuhan bobot rerata harian (%) W t W o t = bobot rata-rata individu pada waktu t (g) = bobot udang pada awal percobaan (g) = lama percobaan (hari) 6. Efisiensi Pemanfaatan Pakan (Takeuchi 1988) (B t + B d ) B o EP (%) = 100 F EP = efisiensi pemanfaatan pakan (%) B t B d B o F = biomassa mutlak udang pada akhir percobaan (g) = biomassa mutlak udang yang mati selama percobaan (g) = biomassa mutlak udang pada awal percobaan (g) = jumlah (g) pakan yang dikonsumsi oleh udang selama
41 percobaan, atau selisih antara total pakan awal dengan total pakan yang tersisa Seluruh data kandungan K + tubuh, gradien osmotik, tingkat konsumsi oksigen, pembelanjaan energi pada metabolisme basal, sintasan, laju pertumbuhan bobot rerata harian, dan efisiensi pemanfaatan pakan dianalisa secara statistik dengan paket program SPSS (SPSS 15.00 for Windows, SPSS Inc, USA) dan Excel 2007 for Windows. Bila berbeda nyata (P<0,05), nilai tengah variabel dianalisa lanjut dengan menggunakan uji Tukey (Steel & Torrie 1991). Uji regresi dilakukan untuk melihat keeratan efek perlakuan terhadap variabel yang diukur. Sedangkan data osmolaritas media, osmolaritas hemolimp, dan kualitas air disajikan secara deskriptif dalam bentuk tabel. Penelitian Tahap Ketiga Waktu dan Tempat Penelitian tahap ketiga dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB selama 28 hari. Analisa proksimat dan kualitas air dilakukan di Laboratorium Nutrisi Ikan dan Laboratorium Lingkungan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Kandungan kalsium dianalisis di Laboratorium Nutrisi Hewan Perah, Fakultas Peternakan, IPB, sedangkan rasio RNA/DNA di Laboratorium Marine Science Technology (MST), Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang dipakai adalah model eksperimental dengan desain Rancangan Faktorial. Percobaan terdiri atas 9 perlakuan (3 3) dengan pengulangan sebanyak 3 kali. Rancangan perlakuan didasarkan pada pemberian kadar protein (25, 35, 45%) dan kalsium (0, 2, 4 %) dalam pakan buatan. Komposisi bahan penyusun pakan perlakuan disajikan pada Tabel 2, sementara hasil analisis proksimat pakan ditampilkan pada Tabel 3.
42 Tabel 2 Komposisi bahan pakan percobaan Bahan Perlakuan protein dan kalsium pakan berbeda A (25;0) B (25;2) C (25;4) D (35;0) E (35;2) F (35;4) G (45;0) H (45;2) I (45;4) Tepung ikan 6,0 6,0 6,0 21,0 21,0 21,0 44,0 44,0 44,0 Tepung terigu 2,0 2,0 2,0 8,5 8,5 8,5 14,0 14,0 14,0 Tepung kedelai 39,5 39,5 39,5 34,0 34,0 34,0 15,5 15,5 15,5 Tepung rebon 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Minyak Ikan 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Minyak cumi 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 Lecithin 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 CMC* 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Selulosa 36,5 32,5 28,5 20,5 16,5 12,5 10,5 6,5 2,5 Vitamin mix.*** 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Mineral mix.tanpa Ca H PO 4 ** 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 CaHPO 4 0,0 4,0 8,0 0,0 4,0 8,0 0,0 4,0 8,0 Total 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 1. CMC : Carboxyl Methyl Cellulose 2. Komposisi Mineral mix (per 100 g) : NaCl 1,0 g, MgSO 4.7H 2 O 15,0 g, NaH 2 PO 4.2H 2 O 25,0 g, KH 2 PO 4 32,0 g, Fe-citrate 2,5 g, Trace element mix. 1,0 g (100 g trace element : ZnSO 4.7H 2 O 35,3 g, MnSO 4.4H 2 O 16,2 g, CuSO 4.5H 2 O 3,1 g, CoCL 2.6H 2 O 0,1 g, KlO 3 0,3 g, selulosa 45 g ) (Takeuchi 1988) 3. Komposisi Vitamin mix. (per 100 g) : vitamin B 1 6 mg, vitamin B 2 10 g, vitamin B 6 4 g, vitamin B 12 0,01 mg, vitamin C 500 mg, Niacin 40 mg, Ca-pantothenate 10 mg, Inositol 200 mg, Biotin 0,6 mg, Folic acid 1,5 mg, p-amino-benzoic acid 5 mg, vitamin K 3 5 mg, vitamin A 4000 IU, vitamin D 3 4000 IU (Takeuchi 1988)
43 Tabel 3 Komposisi proksimat dan kandungan kalsium pakan percobaan Pakan percobaan (perlakuan protein dan kalsium) Bahan A (25;0) B (25;2) C (25;4) D (35;0) E (35;2) F (35;4) G (45;0) H (45;2) I (45;4) Protein 26,15 26,59 26,48 35,80 36,12 35,56 46,59 46,43 46,36 BETN 34,0 34,24 32,65 33,57 33,26 33,28 29,72 30,29 30,22 Lemak 6,18 5,12 7,15 6,56 6,22 6,84 7,73 7,65 7,39 Serat Kasar 25,19 24,14 22,61 16,65 15,52 14,13 9,51 7,91 7,21 Kadar abu 8,48 9,91 11,11 7,42 8,88 10,19 6,45 7,72 8,82 DE* 242,92 242,92 242,92 337,57 337,57 337,57 434,14 434,14 434,14 C/P** 9,55 9,55 9,55 9,52 9,52 9,52 9,54 9,54 9,54 Kalsium 0,79 2,31 3,40 0,71 2,70 3,39 0,76 2,24 3,42 1. DE : kandungan energi (kcal/g pakan) 2. C/P : rasio energi protein pakan
44 Pelaksanaan Percobaan Persiapan dan Pemeliharaan Stok postlarva sebagai hewan uji diperoleh berdasarkan hasil terbaik penelitian sebelumnya. Postlarva diaklimatisasi dalam kondisi laboratorium selama 10 hari, kemudian dilanjutkan tahapan aklimasi secara gradual dari salinitas 25 ppt ke 2 ppt selama 4 hari. Selama aklimasi hingga PL 24, pemberian pakan Artemia tetap dilakukan. Sebelum percobaan pertumbuhan dimulai, seluruh wadah percobaan diatur secara acak dalam suatu sistem resirkulasi. Tata letak wadah perlakuan disajikan dalam Gambar 7. Wadah berupa akuarium berukuran 60 30 40 cm dengan jumlah 27 unit menurut perlakuan yang diterapkan. Sebelum dimasukkan dalam wadah percobaan, air media bersalinitas 2 ppt dipersiapkan melalui pengenceran, selanjutnya ditambahkan CaCO 3 dan K 2 CO 3 sehingga kadar menjadi 70 ppm Ca 2+ dan 41,44 ppm K + yang merupakan kadar optimal penelitian sebelumnya. Setiap wadah akuarium diisi air media sebanyak 45 liter. Seluruh media kemudian diresirkulasi dengan menggunakan beberapa penyaringan terdiri dari kain kapas, kerikil, dan zeolit. Selama penelitian berlangsung, media diaerasi untuk mempertahankan ketersediaan oksigen. Pengaturan lampu dalam ruangan juga dilakukan agar suhu tetap konstan. Pakan perlakuan dibuat 9 macam berdasarkan kadar protein (25%, 35%, 45%) dan mineral kalsium (0%, 2%, 4%). Sumber protein adalah tepung rebon, tepung ikan, dan bungkil kedelai. Rasio energi protein dari perlakuan ditetapkan sama. Penambahan mineral kalsium menggunakan dikalsium fosfat (CaHPO 4 ). Ukuran pelet disesuaikan untuk postlarva yaitu bentuk crumble dengan diameter 0,5 mm. Sebelum dibuat, bahan baku pakan dianalisa proksimat untuk penyusunan komposisi pakan perlakuan. Analisa proksimat juga dilakukan setelah pakan dibuat dalam menentukan kadar bahan penyusun seluruh perlakuan. Pemeliharaan benih berlangsung selama 4 minggu. Saat memasuki percobaan, hewan uji pada stadia PL 25 diseleksi berdasarkan ukuran yang sama dengan bobot awal rata-rata sekitar 0,0279 g. Setiap akuarium ditebar udang sebanyak 15 individu. Pakan diberikan berkisar 8% dari bobot basah tiap hari
45 Gambar 7 Tata letak penempatan wadah penelitian tahap ke-3. dengan frekuensi 4 kali perhari, selanjutnya diatur tiap hari berdasarkan jumlah pakan terkonsumsi. Banyaknya pakan yang diberikan dan sisa pakan selama penelitian dicatat untuk penentuan tingkat konsumsi pakan yang nantinya dijadikan dasar untuk menghitung efisiensi pemanfaatan pakan. Untuk mempertahankan kualitas media pemeliharaan, sisa pakan dan kotoran dikeluarkan dari media dengan cara disipon yang dilakukan sore hari sebelum pemberian pakan. Setiap hari juga dilakukan pergantian air dalam tiap wadah dengan media baru sebanyak 10%. Pengambilan Data Pertumbuhan ditentukan lewat pengambilan data bobot udang dan rasio RNA/DNA. Bersamaan pengamatan jumlah udang yang hidup, dilakukan penimbangan bobot basah setiap 7 hari untuk penentuan efisiensi pakan dan pertumbuhan harian. Pengukuran bobot menggunakan timbangan digital 3 digit dibelakang koma. Evaluasi pertumbuhan selanjutnya berdasarkan pengukuran ratio RNA/DNA pada hari terakhir percobaan. Sekitar 1 individu udang yang tidak sedang ganti kulit dipisahkan dari tiap perlakuan, kemudian diambil bagian otot putih untuk dianalisa. Kandungan DNA dan RNA diukur dengan
46 menggunakan peralatan spektrofotometer (Gene Quant). Prosedur ekstraksi dan pengukuran DNA dan RNA ditampilkan di Lampiran 4-6. Untuk mengetahui kandungan protein kasar, kadar lemak kasar, serat kasar, kadar abu, kadar air, dan BETN dari tubuh hewan dilakukan uji proksimat mengikuti metode yang dikemukakan Takeuchi (1988). Analisa proksimat hewan uji dilakukan pada awal dan akhir percobaan, sedangkan untuk pakan dilakukan sebelum dan sesudah peramuan pakan. Untuk pengukuran proksimat hewan uji saat awal percobaan, dibutuhkan sekitar 200 individu udang karena disesuaikan dengan ukuran sampel, sedangkan pada akhir percobaan, dibutuhkan sekitar 2-3 individu diambil dari setiap unit percobaan. Analisa proksimat untuk protein kasar berdasarkan metode Kjeldhal. Tahapan preparasi sampel hingga analisis disajikan dalam Lampiran 7. Setelah diketahui kandungan proksimat dilakukan perhitungan retensi protein. Pengukuran kandungan kalsium tubuh dilakukan untuk mengetahui penyerapan kalsium pakan oleh udang. Peralatan yang digunakan adalah AAS (Shimadzu AA-680). Udang dalam keadaan fase intermolt atau pada bobot normal yang digunakan dalam pengukuran. Sekitar 2-3 individu dipisahkan dari setiap unit percobaan, kemudian dipreparasi dengan menggunakan bagian keseluruhan tubuh udang. Prosedur preparasi dan pengukuran kalsium seperti pengukuran potasium pada penelitian sebelumnya. Data kalsium tubuh awal, akhir, serta yang terkandung dalam pakan kemudian dicatat untuk menentukan retensi kalsium. Frekuensi ganti kulit dilakukan percobaan tersendiri. Wadah ukuran 15 15 15 cm diisi air media 2 ppt sekitar 2 liter, selanjutnya dimasukkan masing-masing 1 individu. Setiap perlakuan terdiri atas 3 ulangan. Untuk mensuplai kebutuhan oksigen, maka setiap wadah dilengkapi aerasi. Pakan perlakuan diberikan empat kali perhari. Pengambilan data dilakukan dengan menghitung jumlah ganti kulit setiap hari untuk menentukan frekuensi ganti kulit. Untuk menentukan kelayakan kualitas media terhadap udang uji, maka dilakukan pengukuran parameter kualitas air media yang dimulai sejak penelitian tahap awal. Parameter fisika kimia air yang diamati adalah suhu, salinitas, kandungan gas oksigen terlarut (Dissolved Oxygen), ph, alkalinitas, kesadahan, amoniak, dan nitrit. Pengukuran parameter suhu air dilaksanakan dua kali sehari.
47 Tabel 4 Parameter fisika kimia media selama percobaan Parameter Suhu Salinitas DO ph Alkalinitas Kesadahan Amoniak Nitrit Kisaran 27 28 0 C 0 25 ppt 6,1 7,7 mg/l 7,2-8,54 32 400 mg/l 24,02 143,28 mg/l 0,100 0,187 mg/l 0,121 0,275 mg/l Kandungan gas oksigen terlarut diukur sekali seminggu, sedangkan ph, alkalinitas, kesadahan, amoniak, dan nitrit diukur tiga kali pada awal, tengah, dan akhir penelitian. Data kualitas air yang tersaji dalam Tabel 4 menunjukkan bahwa semua parameter yang diukur selama penelitian masih berada pada batas toleransi bagi budidaya udang vaname. Oleh karena itu, kondisi media pemeliharaan mampu mendukung terhadap sintasan dan pertumbuhan postlarva. Analisis Data Untuk mengetahui pengaruh pakan uji, beberapa variabel yang diukur adalah sebagai berikut : 1. Rasio RNA/DNA RNA (μg/mg sampel) = ( RNA D 1 V 1 ) / W 1 DNA (μg/mg sampel) = ( DNA D 2 V 2 ) / W 2 RNA = konsentrasi RNA (μg/ml) DNA = konsentrasi DNA (μg/ml) D 1 = faktor pengencer untuk analisa RNA (40) D 2 = faktor pengencer untuk analisa DNA (20) V 1, V 2 = volume larutan RNA dan DNA (ml)
48 W1, W2 = bobot sampel untuk analisis RNA dan DNA (mg) 2. Retensi Protein (Takeuchi 1988) Bobot protein tubuh akhir - bobot protein tubuh awal (g) RP (%) = 100 Bobot total protein yang dikonsumsi (g) 3. Retensi Kalsium (Takeuchi 1988) Bobot kalsium tubuh akhir - bobot kalsium tubuh awal (g) RCa (%) = 100 Bobot total kalsium yang dikonsumsi (g) 4. Frekuensi Ganti Kulit Analisa frekuensi ganti kulit dilakukan berdasarkan jumlah keseluruhan ganti kulit pada setiap perlakuan. 5. Laju Pertumbuhan Bobot Rerata Harian (Huisman 1976) LPRH (%) = t W t - 1 100 W o LPRH = laju pertumbuhan bobot rerata harian (%) W t W o t = bobot rata-rata individu pada waktu t (g) = bobot udang pada awal percobaan (g) = lama percobaan (hari) 6. Efisiensi Pemanfaatan Pakan (Takeuchi 1988) (B t + B d ) B o EP (%) = 100 F EP = efisiensi pemanfaatan pakan (%) B t B d B o = biomassa mutlak udang pada akhir percobaan (g) = biomassa mutlak udang yang mati selama percobaan (g) = biomassa mutlak udang pada awal percobaan (g)
49 F = jumlah (g) pakan yang dikonsumsi oleh udang selama percobaan, atau selisih antara total pakan awal dengan total pakan tersisa. 7. Sintasan Postlarva (Effendie 2002) S (%) = (N t / N o ) 100 S = persentase udang uji yang hidup (%) N t N o = jumlah individu udang uji pada akhir penelitian (individu) = jumlah individu udang uji pada awal penelitian (individu) Seluruh data rasio RNA/DNA, retensi protein, retensi kalsium, frekuensi ganti kulit, laju pertumbuhan bobot rerata harian, efisiensi pemanfaatan pakan, dan sintasan diuji secara statistik (ANOVA) menggunakan program SPSS (SPSS versi 15.00 for Windows, SPSS Inc. USA), dan Excel 2007 for Windows. Uji Tukey digunakan selanjutnya untuk menentukan perbedaan nilai tengah di antara seluruh variabel (Steel & Torrie 1991). Untuk mengestimasi kadar optimal dari perlakuan, maka seluruh data nilai tengah variabel ditampilkan dalam bentuk tabel. Data kualitas air juga diinterpretasikan secara deskriptif.