BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian dilaksanakan dari Bulan Maret sampai Bulan Juni 2013. Pengujian aktivitas antioksidan, kadar vitamin C, dan kadar betakaroten buah pepaya dan manisan pepaya dilakukan di Laboratorium Riset dan Laboratorium Instrumen Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI. 3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat Alat-alat yang digunakan adalah neraca analitik, alat-alat gelas, buret, blender, pisau, labu ukur, panci aluminium, saringan, pengaduk, toples dan spektrofotometer UV-Vis MINI Shimadzu 1240 dan instrument HPLC. 3.2.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah pepaya mengkal, aquades, metanol, peraksi DPPH, kloroform, pereaksi Mayer, serbuk Mg, asam asetat glasial, HCl 0,1 N, H 2 SO 4 pekat, FeCl 3, NaOH 0,1 N, n-heksana, I 2, Na 2 S 2 O 3.5H 2 O, KIO 3, KI, HCl, KMnO 4 0,1 %, amilum, gula pasir, garam dapur, natrium benzoat.
16 3.3 Cara Kerja 3.3. 1 Bagan Alir Penelitian Bagan Alir penelitian ditunjukan pada gambar 3.1 berikut ini : Pepaya Dicuci, dikupas kulitnya Dipotong kecil-kecil - Dihaluskan dengan blender - Dimaserasi dengan pelarut metanol selama 24 jam Ekstrak Metanol Pepaya Dibuat manisan Manisan pepaya (Variasi Suhu Pemanasan 50 0 C, 60 0 C, 70 0 C, dan 80 0 C ) - Dihaluskan dengan blender - Dimaserasi dengan pelarut metanol selama 24 jam Ekstrak Metanol - Uji Fitokimia - Uji Kualitatif Vitamin C - Uji Kadar Vitamin C dengan Titrasi Iodimetri - Uji Kadar Betakaroten dengan HPLC - Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH Data hasil pengujian
17 Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian 3.3.2 Bagan Alir Pembuatan berikut ini : Bagan alir pembuatan manisan pepaya dapat dilihat pada gambar 3.2 Buah Pepaya - Dicuci, dikupas kulitnya dan dipotong kecil-kecil - Direndam dalam larutan kapur sirih 2 % selama 1 jam - Dicuci dan ditiriskan Pepaya yang sudah direndam larutan kapur larutan kapur sirih sirih - Direndam dalam larutan garam dapur 3-10 % selama 12-48 jam - Dicuci dan ditiriskan Pepaya yang sudah direndam larutan garam larutan garam dapur dapur - Direndam semalaman dalam rebusan larutan gula (1 Kg dalam 1 L air) yang telah ditambah 1 g natrium benzoat Pepaya yang sudah direndam larutan gula semalaman - Dimasak dengan waktu pemanasan 5 menit dan variasi suhu (50,60,70, dan 80 o C) - Direndam kembali semalaman, ditiriskan Air rendaman gula - Dipekatkan dengan cara dipanaskan - Didinginkan Air rendaman gula yang telah dipekatkan dan didinginkan Pepaya yang sudah direndam larutan gula semalaman - Ditiriskan Pepaya yang sudah ditiriskan - Dicampurkan kembali dengan pepaya yang sudah ditiriskan - Direndam semalaman - Dilakukan hal yang sama 3-4 kali Gambar 3.2. Bagan Alir Pembuatan
18 3.3.3 Persiapan Sampel Disiapkan buah pepaya yang mengkal, kemudian dicuci bersih dan kulitnya dikupas. Setelah itu, buah pepaya dipotong kecil-kecil, sebagian dihaluskan dengan blender, sebagian lagi dibuat manisan. 3.3.4 Pembuatan Prosedur pembuatan manisan pepaya dalam penelitian ini merupakan modifikasi dari prosedur Saptoningsih dan Jatnika (2010). Modifikasi yang dilakukan yaitu lama pemanasan buah selama 5 menit. Proses pembuatan manisan pepaya dalam industri rumahan yaitu pertama pepaya dipotong sesuai ukuran, kemudian direndam dalam larutan kapur sirih 2 % (20 gram kapur sirih dalam 1 L air) selama 1 jam, setelah itu pepaya dicuci dan ditiriskan. Selanjutnya pepaya direndam dalam larutan garam dapur konsentrasi 3-10 % selama 12-48 jam, lalu cuci bersih berkali-kali hingga sisa larutan garam dan kapur sirih hilang. Rendam pepaya selama semalam dalam rebusan air gula (1 Kg dalam 1 L air) yang telah didinginkan dan telah ditambah 1 g natrium benzoat. Selanjutnya pepaya dipanaskan selama 5 menit dengan variasi suhu pemanasan 50 o C, 60 o C, 70 o C, dan 80 o C. Menurut Saptoningsih dan Jatnika (2010) proses pemanasan manisan dilakukan pada suhu 60 o C. Oleh karena itu, dalam penelitian ini pembuatan manisan pepaya dilakukan pada variasi suhu pemanasan 50 o C, 60 o C, 70 o C, dan 80 o C. Pemilihan lama pemanasan selama 5 menit berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Rahayu dan Pribadi (2012) yang menyatakan bahwa waktu perebusan 5 menit memberikan penurunan kandungan vitamin C paling kecil dalam manisan pepaya. Setelah dipanaskan, pepaya direndam kembali semalaman. Keesokan harinya pepaya ditiriskan dan larutan gula dipekatkan, selanjutnya rendam kembali pepaya yang sudah ditiriskan ke dalam larutan gula yang telah didinginkan. Lakukan hal demikian 3-4 kali. 3.3.5 Persiapan Ekstrak Pepaya dan Ekstrak Pepaya dan manisan pepaya yang telah halus diekstraksi dengan pelarut metanol sebanyak 75 ml selama 24 jam. Setelah itu ekstrak disaring sehingga
19 didapatkan filtrat. Filtrat kemudian diuapkan dengan vacuum rotary evaporator sehingga didapat ekstrak yang kental. 3.3.6 Uji Fitokimia 3.3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid Sebanyak 1 ml ekstrak ditambah 5 tetes kloroform dan beberapa tetes pereaksi Mayer. Jika terbentuk endapan putih, maka ekstrak positif mengandung alkaloid. 3.3.6.2 Pemeriksaan Flavonoid Sebanyak 1 ml ekstrak ditambah 1 g serbuk Mg dan beberapa tetes HCl pekat. Timbulnya warna kuning menunjukan adanya flavonoid 3.3.6.3 Pemeriksaan Terpenoid dan Steroid Sebanyak 1 ml ekstrak ditambah 1 ml asam asetat glasial dan 1 ml H 2 SO 4 pekat. Timbulnya warna merah menunjukan adanya terpenoid. Sedangkan timbulnya perubahan warna violet menjadi biru atau hijau menunjukan adanya steroid. 3.3.6.4 Pemeriksaan Tanin Sebanyak 1 ml ekstrak ditambah beberapa tetes FeCl 3 1 %. Timbulnya warna biru tua menunjukan adanya tanin. 3.3.6.5 Pemeriksaan Kuinon Sebanyak 1 ml ekstrak ditambah beberapa tetes NaOH 0,1 N. Timbulnya warna merah tua menunjukan adanya kuinon. 3.3.7 Uji Kualitatif Vitamin C Sebanyak 1 ml ekstrak ditambah 5 ml akuades dan 10 ml KMnO 4 0,1 %, timbulnya perubahan menjadi warna coklat menunjukan adanya vitamin C.
20 3.3.8 Penentuan Kandungan Vitamin C Ekstrak Metanol Pepaya dan Ekstrak Metanol Penentuan vitamin C dilakukan dengan menggunakan metode titrasi iodimetri. Sebelum melakukan titrasi iodimetri, dilakukan pembuatan larutan baku. Setelah itu dilakukan standarisasi Na 2 S 2 O 3. 5H 2 O dengan KIO 3 dan standarisasi iodium dengan Na 2 S 2 O 3. 5H 2 O. 3.3.8.1 Pembuatan Larutan KIO 3 0,01 N Sebanyak 0,0356 g padatan KIO 3 dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, ditandabataskan dan dihomogenkan dengan akuades. 3.3.8.2 Pembuatan Larutan Na 2 S 2 O 3. 5H 2 O 0,01 N Sebanyak 0,2482 g padatan Na 2 S 2 O 3. 5H 2 O dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, ditandabataskan dan dihomogenkan dengan akuades. Kemudian dilakukan standarisasi menggunakan KIO 3 0,01 N. 3.3.8.3 Pembuatan Larutan Iodium 0,01 N Sebanyak 0,6345 g serbuk I 2 dan 1 g KI dimasukan ke dalam labu ukur 500 ml ditandabataskan dan dihomogenkan dengan akuades, kemudian didiamkan semalaman. Kemudian dilakukan standarisasi menggunakan Na 2 S 2 O 3. 5H 2 O. 3.3.8.4 Pembuatan Larutan Amilum 1 % Sebanyak 0,25 g serbuk amilum dimasukkan ke dalam gelas kimia, lalu dilarutkan dengan akuades kemudian dipanaskan hingga larutan menjadi jernih. 3.3.8.5 Standarisasi Na 2 S 2 O 3. 5H 2 O dengan KIO 3 0,01 N Larutan KIO 3 0,01 N dimasukkan ke dalam labu Erlenmayer, ditambah 4 ml KI dan 1 ml HCl 4 N kemudian dititrasi dengan larutan Na 2 S 2 O 3. 5H 2 O 0,01 N hingga berubah warna menjadi kuning pucat. Setelah itu, ditambah beberapa tetes indikator amilum, dititrasi kembali hingga larutan berubah warna dari kuning
21 pecat menjadi bening. Diamati volume Na 2 S 2 O 3. 5H 2 O yang terpakai dalam buret dan dihitung normalitasnya. 3.3.8.6 Standarisasi I 2 dengan Na 2 S 2 O 3. 5H 2 O 0,01 N Larutan Na 2 S 2 O 3. 5H 2 O 0,01 N dimasukkan ke dalam labu ErlenMayer, 2 tetes indikator amilum kemudian dititrasi dengan larutan I 2 dari buret hingga terjadi perubahan warna dari bening menjadi biru. Diamati volume I 2 yang terpakai dalam buret dan dihitung normalitasnya. 3.3.8.7 Penentuan Kadar Vitamin C Ekstrak Metanol Pepaya dan Ekstrak Metanol Sebanyak 2 ml sampel dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, kemudian dihomogenkan dan ditandabataskan dengan akuades. Setelah itu, sebanyak 10 ml dari sampel tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, ditambah beberapa tetes indikator amilum, kemudian larutan sampel dititrasi dengan larutan I 2 hingga terbentuk larutan dengan warna biru yang stabil. Diamati volume I 2 yang terpakai dalam buret, dan ditentukan kandungan vitamin C dalam sampel dengan menggunakan rumus berikut ini : Kadar Asam Askorbat = Keterangan : - Volume iodium = volume iodium dari buret yang terpakai selama titrasi - Mg asam askorbat didapat dari : 1 ml larutan iodium 0,01 N ekivalen dengan 0,88 mg asam askorbat - Fp = faktor pengenceran - Massa sampel = massa sam - pel yang digunakan pada saat titrasi.
22 3.3.9 Penentuan Kandungan Betakaroten Ekstrak Metanol Pepaya dan Ekstrak Metanol Manisan pepaya dengan HPLC Sebelum dilakukan analisis terhadap sampel dengan menggunakan HPLC, sampel dipreparasi terlebih dahulu. Sebanyak 15 ml sampel di ekstraksi cair-cair dengan menggunakan pelarut n-heksana. Fasa atas ditampung dalam botol vial, fasa bawah diekstraksi kembali. Proses ekstraksi dilakukan sampai tidak terbentuk lagi warna oranye. Fasa atas kemudian dianalisis kandungan betakaroten dengan HPLC. Parameter dalam pengujian HPLC yaitu Standar : Betakaroten Fasa gerak : Metanol :Asetonitril 3:1 Laju alir Detektor λ detektor : 0,75 ml/menit : UV : 198,5 nm berikut ini: Untuk menghitung kadar betakaroten pada sampel digunakan rumus Kadar betakaroten (ppm) = Konsentrasi Standar 3.3.10 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH menurut Biranti (2009) dan Okawa (2001). Sampel adalah ekstrak metanol pepaya atau ekstrak metanol manisan pepaya. Sebelum dilakukan uji aktivitas antioksidan pada sampel, dilakukan pembuatan kurva kalibrasi DPPH. Sebanyak 5 mg DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml dan dilarutkan dengan metanol. Larutan DPPH yang dibuat memiliki konsentrasi 100 ppm. Kemudian dilakukan pengenceran di dalam labu ukur 10 ml sehingga didapat konsentrasi 5,10,15,20
23 dan 25 ppm. Selanjutnya dilakukan scanning panjang gelombang absorbansi maksimum. Setelah didapat panjang gelombang absorbansi maksimum, kemudian sampel diukur absorbansi dengan menggunakan spektrometer UV-Vis pada panjang gelombang sesuai hasil scanning panjang gelombang absorbansi maksimum. Untuk pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan cara sebanyak 5 ml sampel dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml dan ditambah pelarut metanol hingga tanda batas kemudian dikocok. Selanjutnya dari ekstrak tersebut dipipet 4 ml lalu disimpan dalam botol vial yang telah dilapisi aluminium foil. Selanjutnya ditambah DPPH 20 ppm sebanyak 2 ml lalu ditutup dan diinkubasi selama 30 menit. Setelah itu, dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 516 nm. Aktivitas antioksidan dapat diukur dengan menggunakan rumus: % Aktivitas Antioksidan = 100 % Keterangan: Abs DPPH kontrol : absorbansi DPPH sebelum direaksikan dengan ekstrak metanol pepaya atau manisan pepaya Abs DPPH sisa : absorbansi DPPH setelah direaksikan dengan ekstrak metanol pepaya atau manisan pepaya