III. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian a. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah jamur yang memiliki tubuh buah, serasah daun, ranting, kayu lapuk, dan tanah yang diperoleh dari kebun karet PT. Perkebunan Nusantara IX (Persero) Kebun Krumput Banyumas Jawa Tengah. Bahan yang digunakan untuk melakukan isolasi dan seleksi adalah aquades steril, medium Potato Dextrose Agar (PDA), alkohol 70%, kloramfenikol, dan medium Bavendamm (PDA + asam galat). b. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah masker, alat tulis, kamera digital, autoklaf, Laminar Air Flow (LAF), oven, kantong plastik, kertas label, timbangan analitik, cawan petri, gelas ukur, jarum ose, pipet seukuran (5 ml dan 10 ml), pipet tetes, skalpel, wrapper, pembakar spirtus, beaker glass (200 ml, 500 ml, dan 1000 ml), kapas, magnetik stirrer, labu Erlenmeyer 250 ml, batang pengaduk, bor gabus (diameter 4 mm), kompor gas, aluminium foil, kaca preparat, kaca objek, mikrometer okuler, kertas tissue, kapas, tabung reaksi, mikroskop, alat pemantik, dan pinset. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Tahapan pengambilan sampel jamur dilakukan di kebun karet PT. Perkebunan Nusantara IX (Persero) Kebun Krumput Banyumas, pada bulan Januari 2014. Inventarisasi terdiri atas tahapan isolasi, seleksi, dan identifikasi jamur pelapuk putih akan dilakukan di Laboratorium Mikologi dan Fitopatologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman.
B. Metode Penelitian dan Cara Kerja 1. Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode survai dengan teknik pengambilan sampel secara acak terpilih ( Purposive Random Sampling) di kebun karet PT. Perkebunan Nusantara IX (Persero) Kebun Krumput Banyumas Jawa Tengah. Identifikasi sampel jamur pelapuk putih yang didapat berdasarkan ciri morfologinya. 2. Parameter Parameter utama yang diamati adalah hasil isolasi dan seleksi jamur pelapuk putih. Parameter pendukung yang diamati yaitu warna koloni, warna sebalik koloni, diameter miselium, tipe pertumbuhan, tekstur permukaan koloni, pigmentasi media berdasarkan uji Bavendam, serta diameter hifa. 3. Cara Kerja 3.1 Pembuatan medium PDA terdapat pada Lampiran 1 (Atlas, 1995). 3.2 Pembuatan medium seleksi jamur pelapuk putih (medium Bavendam) terdapat pada Lampiran 2 (Nishida et al., 1988). 3.3 Pengambilan Sampel Sampel jamur diambil secara acak di kawasan kebun karet PT. Perkebunan Karet Nusantara IX (Persero) Kebun Krumput Banyumas (Lampiran. 3) menggunakan metode jelajah, dengan mencari dan mengumpulkan jamur yang mempunyai tubuh buah, tanah yang mengandung serasah atau bahan organik, ranting, dan kayu yang sudah lapuk (Arif et al., 2008). Sampel jamur diamati secara visual dan didokumentasikan. Sampel kemudian disimpan ke dalam kantong plastik dan diberi label untuk selanjutnya dibawa ke laboratorium dan dilakukan tahapan selanjutnya. 3.4 Isolasi jamur pelapuk putih, seleksi isolat jamur pelapuk putih, identifikasi dan koleksi jamur pelapuk putih. a. Isolasi jenis-jenis jamur yang diperoleh dari lapangan dilaksanakan di laboratorium, dengan tahapan: 11
1). Isolasi jamur dengan menggunakan metode tanam langsung (Arif et al., 2008) Metode ini digunakan pada sampel jamur yang ditemukan pada kayu yang sudah lapuk, ranting maupun pada serasah daun serta jamur makroskopis. Sampel jamur yang sudah dipotong kecil sebelum dibiakkan dilakukan sterilisasi permukaan dengan memasukkannya ke dalam larutan alkohol 70% selama 1 menit, kemudian dibilas dengan akuades steril ± 5 detik dengan tiga kali ulangan, setelah itu dikeringkan dengan tissue steril ± 1 menit, selanjutnya ditanam ke medium PDA. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama ± 3-4 hari sampai terlihat adanya pertumbuhan miselium jamur. Biakan yang tumbuh selanjutnya dimurnikan pada medium PDA yang baru, dengan cara memindahkannya menggunakan bor gabus yang berdiameter 4 mm. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama ± 3-4 hari sampai terlihat adanya pertumbuhan jamur tunggal. 2). Isolasi dengan menggunakan metode pengenceran (Arif et al., 2008) Metode ini digunakan pada sampel yang berasal dari tanah. Prosedur isolasi diawali dengan pengambilan sampel tanah sebanyak 1 gram, kemudian dilarutkan ke dalam 9 ml akuades steril dihomogenkan dengan mengocoknya sampai tercampur. Pengenceran dilakukan dengan cara mensuspensikan 1 ml ke dalam 9 ml akuades steril dan seterusnya sampai pada pengenceran 10-7. Sebanyak 0,1 ml, dituang pada cawan petri yang berisi media, selanjutnya diratakan. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 3-4 hari sampai terlihat adanya pertumbuhan miselium jamur. Biakan campuran yang tumbuh selanjutnya dimurnikan pada medium PDA yang baru, dengan cara memindahkannya menggunakan bor gabus yang berdiameter 4 mm. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 3-4 hari sampai terlihat adanya pertumbuhan jamur tunggal. 12
b. Seleksi jamur pelapuk putih (Nishida et al., 1988) Jamur tunggal (murni) yang diperoleh dari hasil isolasi kemudian diinokulasikan ke cawan yang sudah berisi medium Bavendam. Jamur ditumbuhkan di tempat gelap (kotak tertutup) selama ± 3-4 hari, apabila pada medium tidak terbentuk warna cokelat berarti uji Bavendam negatif ( -), artinya jamur tersebut tidak dapat mengoksidasi asam galat sehingga jamur ini dapat dikelompokkan ke dalam jamur pelapuk cokelat. Apabila terbentuk warna cokelat pada medium, berarti uji Bavendam positif (+), artinya jamur tersebut dapat mengoksidasi asam galat sehingga jamur ini dapat dikelompokkan ke dalam jamur pelapuk putih. Warna cokelat yang terbentuk karena adanya reaksi fenol oksidase (Rayner dan Boddy, 1988). c. Identifikasi jamur pelapuk putih. Identifikasi dilakukan dengan mengamati ciri makroskopis dan mikroskopis. Jamur yang diidentifikasi adalah jamur hasil seleksi dari jamur pelapuk putih. Parameter utama jamur makroskopik yang diamati yaitu bentuk tudung, warna tudung, tepi tudung, bentuk tangkai, dan perlekatan tangkai pada tudung. Parameter utama jamur mikroskopik yang diamati yaitu warna koloni, warna sebalik koloni, diameter miselium, pigmentasi medium berdasarkan uji Bavendam, diameter hifa, ukuran spora dan warna spora. Parameter pendukung yang diamati yaitu suhu dan kelembapan. (Arif et al., 2008). Pengukuran diameter hifa dilakukan dengan cara meletakkan 1 ose hifa jamur yang tumbuh pada medium Bavendam diatas kaca obyek yang telah ditetesi media yang sudah memadat kemudian ditutup dengan kaca objek. Preparat tersebut diletakkan di dalam cawan petri dan diberi pelembap berupa kertas tissue steril yang dibasahi dengan akuades steril. Diinkubasi selama ± 1 hari, setelah itu, diukur diameter hifanya dengan menggunakan mikrometer okuler (Musa et al., 2011). Identifikasi dilakukan dengan mencocokkan ciri-ciri dengan mengacu pada buku identifikasi jamur, yaitu Largent dan Johnshon (1977), Domsch dan Gams (1980), Burnett dan Hunter (1972), dan Streets (1980) sampai tingkat genus. Identifikasi hanya dilakukan pada isolat jamur yang 13
memberikan hasil positif pada uji Bavendam. Sampel jamur yang didapat didokumentasikan menggunakan kamera. d. Koleksi jamur pelapuk putih Koleksi dilakukan dengan memberikan nomor, nama spesies, lokasi tempat pengambilan, tanggal pada saat isolasi, tempat tumbuh, dan ciri khas atau spesifik dari identifikasi jamur pelapuk putih secara makroskopis maupun mikroskopis C. Metode Analisis Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif. Untuk memperjelas hasil pengamatan visual, dibuat dokumentasi dalam bentuk foto makromorfologi dan mikromorfologi. 14