III. BAHAN DAN METODE A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Pengolahan Hasil Pertanian dan Laboratorium Analisis Kimia Hasil Pertanian Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Universitas Lampung. Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2008 sampai dengan Juni 2009. B. Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah daging buah kelapa setengah tua yang diperoleh dari pasar tradisional Way Halim, ubi jalar, air kelapa hijau, air, gula, garam fisiologis 0,85%, MRS Agar dan Broth, susu skim, pectin, alkohol 70%, kultur bakteri asam laktat yaitu Lactobacillus casei FNCC 0090, phenolptalein, dan NaOH 0,1 N. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi panci, kompor, baskom, kain saring, thermometer, refrigerator (merk LG), incubator (merk Memmert), homogenizer, autoclave (Hirayama), waterbath, timbangan analitik (merk AND EK-6006), blender juicer (merek Philips), cawan Petri, jarum ose, ph meter (merk Hanna), tabung reaksi (merk Pyrex), buret, Erlenmeyer (merk Pyrex), gelas ukur (merk Pyrex), dan batang pengaduk.
20 C. Metode Penelitian Penelitian terdiri dari dua percobaan yaitu (1) Percobaan untuk mengetahui konsentrasi pati (0,5,10,15 dan 20 %) dari ketiga jenis sari ubi jalar terhadap pertumbuhan Lactobacillus casei FNCC 0090 dan percobaan kemampuan tumbuh Lactobacillus casei FNCC 0090 pada susu fermentasi yang diberi konsentrasi dari ketiga jenis sari ubi jalar, (2) Evaluasi karakteristik susu yang difermentasi selama penyimpanan dingin. 1. Penelitian tahap pertama Penelitian tahap pertama dilakukan untuk memperoleh konsentrasi terbaik dari ketiga jenis sari ubi jalar yang ditambahkan kedalam susu fermentasi berbahan santan kelapa dan difermentasi dengan kultur bakteri asam laktat Lactobacillus casei FNCC 0090 sebanyak 2% (jumlah BAL minimal 10-7 cfu/ml). Fermentasi dilakukan selama 24 jam dan setiap 4 jam dilakukan pengamatan terhadap ph, total asam, Optical Density (OD) untuk penentuan doubling time dan sensori. Hasil penelitian tahap pertama akan digunakan pada penelitian tahap berikutnya (Gambar 2). Data dianalisis dengan sidik ragam apabila terdapat perbedaan dilanjutkan dengan uji BNT pada taraf 5%.
21 Susu kelapa sari ubi jalar 0,5,10,15,20 % Homogenisasi Pasteurisasi, suhu 85 o C, 1 menit Ditambahkan kultur kerja Lactobacillus casei sebanyak 2% (10 7 cfu/ml) Pengamatan ph, stabilitas, Optical Density (OD) Gambar 2. Prosedur penelitian tahap pertama menentukan konsentrasi terbaik dari ketiga jenis sari ubi jalar 2. Penelitian tahap kedua Penelitian tahap kedua ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan tumbuh Lactobacillus casei yang ditambahkan kedalam susu fermentasi santan kelapa yang disimpan pada suhu dingin (suhu 4 0 C ± 1 0 C) selama 28 hari penyimpanan. Pengamatan dilakukan setiap 7 hari selama 28 hari penyimpanan. Pengamatan meliputi ph, total asam sebagai asam laktat, kestabilan, viskositas, total bakteri asam laktat dan sensori (Gambar 3). Data dianalisis dengan sidik ragam apabila terdapat perbedaan dilanjutkan dengan uji Duncan pada taraf 5%.
22 Susu kelapa 20 % sari ubi jalar Homogenisasi Pasteurisasi, suhu 85 o C 1 menit Ditambahkan kultur kerja Lactobacillus casei sebanyak 2% (v/v) Fermentasi selama 24 jam, suhu 37 o C Penyimpan pada suhu 4ºC 1 C Pengamatan setiap 7 hari selama 28 hari penyimpanan terhadap Pengamatan total asam, ph, stabilitas, total BAL, sensori Gambar 3. Prosedur penelitian kedua menentukan kemampuan tumbuh Lactobacillus casei FNCC 090 dalam susu fermentasi berbahan santan kelapa dengan penambahan sari ubi jalar 20%
23 D. Pelaksanaan Penelitian 1. Penyegaran dan pembuatan starter Kultur bakteri asam laktat dari ampul ditumbuhkan pada media MRS Broth, kemudian diinkubasi pada suhu 37 O C selama 24 jam. Dari MRS Broth tersebut sebanyak 1 ml kultur dimasukkan kedalam 50 ml susu skim 5% yang telah disterilisasi pada suhu 121 O C selama 15 menit, selanjutnya diinkubasi 24 jam pada suhu 37 O C sebagai kultur antara. Starter yang diinokulasikan pada susu kelapa adalah dalam bentuk kultur kerja yang dibuat dengan menginokulasikan kultur antara sebanyak 1 ml kedalam susu skim 5% yang ditambahkan glukosa 5% sebanyak 1 ml diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 O C sebagai kultur kerja (Rakhmiati, 2008). Skema pembuatan kultur kerja dapat dilihat pada Gambar 4. Kultur murni BAL MRS Broth (24 jam 37ºC) MRS Agar kultur stock Diambil 1-2 ose dimasukkan dalam suhu skim 5% steril (dinkubasi 24 jam 37ºC) Kultur induk Diambil 1ml dimasukkan dalam susu skim 5% (dinkubasi 24 jam 37ºC) Kultur antara Diambil 1ml dimasukkan dalam susu skim 5% dan gula 3% steril (dinkubasi 24 jam 37ºC) Kultur kerja Gambar 4. Diagram alir pembuatan starter
24 2. Pembuatan susu kelapa Daging buah kelapa dikupas untuk menghilangkan testanya, dicuci dan kemudian diblanching dengan suhu 80 O C selama 5 menit untuk menonaktifkan enzim, kemudian diekstrak dengan menggunakan blender jucer (Rakhmiati, 2008 yang dimodifikasi). Hasil ekstrak tersebut ditambahkan air kelapa muda dengan perbandingan 4 bagian air kelapa dan 1 bagian ekstrak kelapa kemudian dihomogenisasi dengan menggunakan blender juicer. Selanjutnya disaring dan filtrat yang dihasilkan ditambahkan pektin 1% (b/v), dihomogenisasi selama 3 menit. Campuran ini dipasteurisasi dengan menggunakan microwave. Suhu pasteurisasi diatur dengan cara memilih menu 8 yang tertera pada microwave (suhu ±85 0 C) selama 1 menit dan didinginkan (Gambar 5). 3. Pembuatan sari ubi jalar Ubi jalar utuh diblansing, dikupas, dicuci, dipotong kecil dan dihancurkan dengan blender, dipasteurisasi dengan microwave oven suhu 85 o C sekitar 1-2 menit (Hidayat dkk, 2006 yang dimodifikasi), kemudian disaring dengan kain saring untuk memisahkan suspensi pati dan ampas. Suspensi pati didiamkan terlebih dahulu selama 24 jam, lalu cairannya diambil sebagai sumber prebiotik, sedangkan endapan pati dibuang. Diagram alir proses pembuatan sari ubi jalar disajikan pada Gambar 6.
25 Daging kelapa muda (500 g) Kulit daging dan air kotor Pengupasan dan Pencucian Air Pemotongan dan Diblansing (80 o C, selama 5 menit) Penggilingan/Pemarutan Pencampuran parutan kelapa Parutan kelapa : air kelapa (1 : 4) Air kelapa muda Ampas Pemerasan dengan Blender juicer* Filtrat Penambahan pektin 1 % Homogenisasi Pasteurisasi microwave (85 o C, 1 )* Minuman susu kelapa (2000 ml) Gambar 5. Diagram alir pembuatan susu kelapa Sumber : Rakhmiati, 2008 yang dimodifikasi Keterangan : * = yang dimodifikasi
26 Ubi Jalar Blansing pada suhu 80 0 C selama 5 menit Pengupasan dan pemotongan Penghancuran dengan blender 1500 rpm 10 menit Pasteurisasi dengan microwave (2,85 o C)* Penyaringan dengan kain saring Ampas Suspensi pati Pendiaman (24 Jam) suhu kamar (28 30 0 C) Padatan Dekantasi Cairan / sari ubi jalar Gambar 6. Diagram alir pembuatan sari ubi jalar Sumber: Hidayat dkk, 2006 yang di modifikasi Keterangan : * = yang dimodifikasi
27 4. Fermentasi susu kelapa Susu kelapa yang telah dingin diinokulasi dengan kulur kerja Lactobacillus casei sebanyak 2% (v/v) dan ditambahkan sari ubi jalar, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 O C pada suasana anaerob sehingga dihasilkan produk susu fermentasi (Rakhmiati, 2008 yang dimodifikasi). Setelah fermentasi selesai, susu fermentasi kelapa dihomogenisasi dengan cara dikocok secara manual. Diagram alir pembuatan susu kelapa fermentasi terdapat pada Gambar 7. Susu fermentasi kelapa yang dihasilkan disimpan pada suhu 4 0 C ± 1 0 C. Setiap 7 hari dilakukan pengamatan sampai hari k-28 terhadap ph, total asam sebagai asam laktat, kestabilan, viabilitas,viskositas, total bakteri asam laktat dan sensori. E. Parameter Pengamatan 1. Optical density (OD) Sampel susu kelapa prebiotik telah difermentasi oleh Lactobacillus casei FNCC 0090 selama 24 jam diambil sebanyak 1 ml, lalu diencerkan dalam 9 ml aquades steril. Blangko yang digunakan adalah susu kelapa yang ditambahkan sari ubi jalar sesuai dengan jenis ubi jalarnya, tetapi tidak ditambahkan Lactobacillus casei FNCC 0090. Blangko yang telah diencerkan ke dalam 9 ml aquades steril dimasukkan ke Spectronic 20 dengan panjang gelombang 500 nm (AOAC, 2000). Selanjutnya blangko dikeluarkan, lalu dimasukkan sampel susu kelapa prebiotik dan lihat nilai absorbansinya.data yang diperoleh kemudian diplotkan untuk memperoleh persamaan garis dan diambil nilai μ (Shin et al., 2000) untuk dimasukkan ke rumus sebagai berikut : doubling time = ln2/µ
28 2. Nilai ph Sampel ditimbang sebanyak 5 ml, dan dimasukkan ke dalam 10 ml aquades, dan dikocok sampai homogen (AOAC, 2000). Sebelum digunakan, ph meter dinyalakan, dibiarkan stabil selama 15 30 menit. Elektroda dibilas dengan aquades dan dikeringkan dengan kertas tisu. Setelah itu elektroda dicelupkan ke dalam media minuman susu kelapa, pengukuran ph diset. Elektroda dibiarkan tercelup beberapa saat sampai diperoleh pembacaan yang stabil. Sebelum pengukuran sampel, ph meter distandarisasi dengan buffer fosfat ph 7 dan ph 4. Tahap-tahap yang harus dilakukan dalam standarisasi ph meter sama dengan cara pengukuran sampel. 3. Total asam Sampel sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 50 ml (AOAC, 2000). Ditambahkan 2-3 tetes indikator fenolftalein, kemudian dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N hingga terbentuk warna merah muda. Total asam dihitung sebagai persen asam laktat. Perhitungan total asam sebagai persen asam laktat menggunakan rumus : V x N x FP x 90 Persen asam laktat x 100% B x 1000 Keterangan : V = Volume larutan NaOH (ml) 90 = Berat molekul asam laktat N = Normalitas larutan NaOH (0,1N) FP = Faktor pengenceran B = Berat contoh (g)
29 Minuman susu kelapa (100 ml) Sari ubi jalar (25 ml) Pasteurisasi 2 menit, 80 0 C* Ditambahkan Kultur kerja Lactobacillus casei sebanyak 2% (2,5 ml)* Homogenasi dengan homogenizer 10 15 menit Inkubasi 37ºC,24 jam mikroaerofilik Susu fermentasi santan kelapa Gambar 7. Diagram alir proses pembuatan minuman susu kelapa fermentasi Sumber : Rakhmiati (2008) yang dimodifikasi Keterangan : * = yang dimodifikasi 4. Total Bakteri Asam Laktat Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi larutan pengencer NaCl 0,85% steril sebanyak 9 ml, dihomogenkan untuk mendapatkan pengenceran 10-1 (Fardiaz, 1989). Sebanyak 1 ml pengenceran 10-1 ditambahkan NaCl 0,85% steril sebanyak 9 ml, dan dikocok hingga homogen, kemudian dilakukan pengenceran sampai 10-8. Sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran dituang kedalam cawan petri. Setelah itu ditambahkan MRS agar steril yang sudah didinginkan pada suhu 45-50 0 C, kemudian digoyang secara mendatar. Setelah membeku, cawan diinkubasi dalam posisi terbalik pada suhu 30-37 0 C pada suasana anaerob selama 48 jam. Cawan petri yang telah diinkubasi
30 tersebut dihitung total koloni dengan colony counter, dari setiap pengenceran yang dilakukan. 5. Viabilitas Susu kelapa yang telah ditambahkan kultur Lactobacilus casei diinkubasi secara anareob pada suhu 37º C selama 24 jam. Sebagai kontrol digunakan susu kelapa tanpa di gunakan prebiotik. Semua sampel yang sudah diinkubasi disimpan pada suhu 4,0 ± 1ºC. Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi larutan pengencer air pepton steril 0,1% sebanyak 9 ml, dihomogenkan untuk mendapatkan pengenceran 10-1. Sebanyak 1 ml pengenceran 10-1 ditambahkan pepton steril 0,1% sebanyak 9 ml, dan dikocok hingga homogen, kemudian dilakukan pengenceran sampai 10-8. Sebanyak 1 ml dari masingmasing pengenceran dituang ke dalam cawan petri dan ditambahkan MRS agar steril yang sudah didinginkan pada suhu 45-50 0 C, kemudian digoyang secara mendatar. Setelah membeku, cawan dimasukkan dalam posisi terbalik kedalam jar yang dimasukkan lilin kemudian di tutup untuk memeberikan kondisi an aerob. Cawan diinkubasi pada suhu 37 0 C pada suasana anaerob selama 72 jam. Cawan petri yang telah diinkubasi tersebut dihitung total koloni dengan colony counter, dari setiap pengenceran yang dilakukan. Perhitungan persen viabilitas (Shin et al., 2000) setiap kultur dihitung menggunakan perhitungan sebagai berikut : % Viabilitas = CFU selama 28 hari penyimpanan x 100% CFU awal
31 6. Stabilitas selama penyimpanan (tingkat keasaman (ph) dan fase pemisahan) Tingkat keasaman dari susu fermentasi santan kelapa yang disimpan pada suhu 4 0 C diukur menggunakan ph meter setelah penyimpanan 0, 7, 14, 21,dan 28, setiap perlakuan dilakukan secara duplo. Untuk mengukur fase pemisahan, sebanyak 100 ml sampel susu fermentasi santan kelapa dimasukan ke dalam gelas ukur dan disimpan pada suhu 4 0 C 1 C selama 28 hari (Oliveira et al., 2002). Pengukuran dilakukan antara cairan dan endapan pada setiap 0, 7, 14, 21, dan 28 hari. Hasil pengukuran dinyatakan dalam persen. a b Stabilitas penyimpanan = a_ a+b a = tinggi bagian keruh b = tinggi bagian jernih 7. Viskositas Pengujian viskositas dilakukan dengan menggunakan viskometer (merk Brookfield). Sampel sebanyak 25 ml dimasukan ke dalam gelas beker 80 ml. Pada viskometer dipasang pengaduk (spindel) no. 2 dengan kecepatan 12 selama 5 menit setelah itu nilai dial reading dibaca. Sebelumnya sampel terlebih dahulu didiamkan pada suhu ruang setelah dikeluarkan dari refrigerator sampai suhunya normal. Perhitungan : Viskositas (centipoise) = (dial reading x faktor)
32 8. Uji Sensori Untuk mengetahui kriteria susu prebiotik dan penerimaan panelis akan dilakukan pengujian produk susu kelapa terhadap warna, rasa dan aroma. Uji sensori ini melibatkan 20 orang panelis tidak terlatih (mahasiswa) untuk pengujian skoring dan hedonik (Nawansih dkk, 2005). Di bawah ini contoh kuesioner yang di gunakan untuk uji organoleptik. Kuesioner Nama :... Sampel : Susu Kelapa + sari ubi jalar Tanggal :... Dihadapan Anda disajikan 5 sampel susu kelapa. Evaluasilah satu per satu dan nyatakan tingkat kesukaan dan ketidaksukaan Anda terhadap sampel dengan menggunakan skala hedonik yang tepat. Kode Sampel 650 019 074 821 136 Parameter Warna Rasa Penampakan Komentar/Alasan Keterangan : 1 = sangat suka 2 = agak suka 3 = netral 4 = agak tidak suka 5 = sangat tidak suka Gambar 8. Contoh kuisioner uji organoleptik tahap pertama
33 Kuesioner Nama :... Sampel : Susu Kelapa + sari ubi jalar Tanggal :... Dihadapan Anda disajikan 9 sampel susu kelapa. Evaluasilah satu per satu dan nyatakan tingkat kesukaan dan ketidaksukaan Anda terhadap sampel dengan menggunakan skala hedonik yang tepat. Parameter Warna Rasa Penampakan Kode Sampel 000 111 222 333 444 555 010 015 020 Keterangan : 1 = suka 2 = agak suka 3 = tidak suka Gambar 9. Contoh kuisioner uji organoleptik penelitian utama