VI. PEMBAHASAN Praktikum yang dilaksanakan tanggal 21 Maret 2011 ini mengenai isolasi bakteri dan kapang dari bahan pangan. Praktikum ini dilaksakan dengan tujuan agar praktikan dapat mengerjakan pewarnaan gram, dapat mengerjakan preparat isolasi kapang dan dapat membedakan jenis-jenis bakteri. Bahan pangan adalah sumber gizi selain bagi manusia, juga sebagai sumber makanan bagi perkembangan mikroorganisme (Buckle dkk, 1987). Populasi jasad renik yang terdapat pada setiap makanan, menyangkut jumlah dan jenisnya, biasanya sangat bervariasi. Hal ini disebabkan karena pengaruh selektif terhadap jumlah dan jenis jasad awal yang terdapat pada makanan. Sumber-sumber mikroflora yang terdapat pada makanan dapat berasal dari tanah, air permukaan, debu, kotoran hewan atau manusia, lingkungan, udara dan sebagainya. Berbagai pengaruh selektif menyebabkan satu atau beberapa jenis jasad renik menjadi dominan terhadap jasad renik lainnya (Fardiaz, 1992). Isolasi berarti memisahkan bakteri dari kapang artinya memisahkan satu jenis bakteriatau kapang dari satu kelompok atau campuran menjadi satu biakan murni, yaitu biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme (Sumanti, 2008). Teknik dan metode isolasi dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu: 1. Metode gores / gesek (strek plate method), yaitu sampel dibuat suspense, kemudian di ambil dengan jarum inokulasi dan digoreskan pada medium dalam cawan petri dengan pola tertentu sehingga koloni-koloni yang tumbuh terpisah satu sama lainnya dapat diisolasi lebih lanjut. 2. Metode tuang (poures plate method), yaitu sampel dibuat suspense dulu (biasanya melalui serangkaian pengenceran), kemudian suspensi dicampur medium dan seterusnya dituangkan ke dalam cawan petri. Koloni yang tumbuh selama masa inkubasi selanjutnya diambil dengan jarum inokulasi dan digesekkan pada medium agar miring steril (Sumanti,2008). Metode yang digunakan dalam praktikum ini adalah metode tuang (poures plate method). Kultur murni yang dibuat yaitu bakteri dan kapang
dari tiap-tiap sampel. Sampel yang digunakan ialah rendang, ayam kecap, sayur sam dan sayur nangka. Dengan pengisolasian ini, maka dapat diketahui kandungan bakteri dan kapang dari tiap-tiap sampel serta keamanan dari sampel tersebut. Sedangkan media yang digunakan pada praktikum kali ini adalah NA dan PDA. Media NA digunakan untuk mengisolasi bakteri. Setelah inkubasi, dilakukan pewarnaan gram pada bakteri yang tumbuh untuk mengetahui jenis bakteri yang diisolasi. Sedangkan media PDA digunakan untuk mengisolasi kapang. Setelah isolasi selama dua hari, isolat atau kuoltur murni yang didapat diamati dengan menggunakan mikroskop. A. Isolasi Bakteri Bakteri terdapat secara luas di lingkungan alam yang berhubungan dengan hewan, tumbuh-tumbuhan, udara, air dan tanah. Pada kenyataannya sangat sedikit sekali lingkungan yang bersih dari bakteri. Adanya bakteri pada bahan pangan dapat mengakibatkan pembusukan yang tidak diinginkan dan menimbulkan penyakit yang ditularkan melalui makanan atau dapat melangsungkan fermentasi yang menguntungkan (Buckle dkk,1987). Media yang digunakan untuk mengisolasi bakteri pada praktikum kali ini adalah Nutrient Agar (NA). NA adalah media yang mengandung 3 gram beef extact, 5 gram pepton, 15 gram bacto agar yang memiliki spesifikasi untuk pertumbuhan bakteri dan dan 1 liter akuades. Praktikum diawali dengan melakukan pengenceran hingga 10-4. pengenceran yang digunakan untuk mengisolasi bakteri adalah pengenceran 10-3 dan 10-4. Hasil dari kedua pengenceran tersebut di tuangkan kedalam cawan petri sebanyak 1 ml, kemudian media NA dituangkan pada masing-masing cawan petri tersebut. Selanjutnya dilakukan inkubasi. Inkubasi isolat bakteri dengan medium NA dilakukan pada suhu 30 C selama dua hari. Setelah selesai inkubasi, dilakukan perhitungan koloni dengan metode SPC, pembuatan film, pewarnaan gram, lalu pengamatan bakteri menggunakan mikroskop. Hasil dari pengamatan bakteri tersebut dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Perhitungan koloni, SPC, dan Hasil Pewarnaan Gram Sampel Jumlah Koloni 10-3 10-4 Perhitungan SPC Pewarnaan Gram Rendang 3 3 < 3,0 x 10 4 ( 3,0 x 10 3 ) Basil, gram positif Ayam Kecap 3 8 < 3,0 x 10 4 ( 3,0 x 10 3 ) Spiral, gram negatif Sayur Asam - 5 < 3,0 x 10 5 ( 5,0 x 10 4 ) Terkontaminasi Sayur Nangka 36 5 3,6 x 10 4 Coccus, gram positif Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2011 Berdasarkan tabel di atas, hasil analisis mikrobiologi dengan cara hitungan cawan atau metode tuang dalam isolasi dilaporkan dalam suatu bentuk standar yang disebut Standard Plate Counts (SPC) sebagai berikut: 1. Cawan yang dippilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 dan 300. 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni. 3. Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni (Fardiaz, 1992). Cara pelaporan dan perhitungan koloni dalam SPC ditentukan sebagai berikut: 1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka yaitu angka pertama (satuan) dan angka kedua (desimal). Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua. Sebagai contoh, 1,7 x 10 3 unit koloni/ml atau 2.0 x 10 6 unit koloni/gram. 2. Jika pada semua pengenceran dihasilkan kurang dari 30 koloni pada cawan petri, berarti pengenceran yang dilakukan terlalu tinggi. Oleh karena itu, jumlah koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
3. Jika pada semua pengenceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri, berarti pengenceran yang dilakukan terlalu rendah. Oleh karena itu, jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan faktor pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung. 4. Jika pada cawan adri dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni dengan jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan dua, dilaporkan rata-rata kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan faktor pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil. 5. jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu. Oleh karena itu, harus dipilih tingkat pengenceran yang menghasilkan kedua cawan duplo dengan koloni di antara 30 dan 300 (Fardiaz, 1992). Berdasarkan data yang diperoleh pada tabel 1, selain dilakukan perhitungan SPC juga pengamatan pada bakteri. Hasil pengamatan bakteri sebagai dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2. Hasil Pengamatan Isolasi Bakteri dari Bahan Pangan Sampe Visual Media NA Bentuk Rendang -bakteri gram postif -bentuk basil -koloni berwarna putih
Ayam Kecap -bakteri gram negatif -bentuk spiral Sayur Asam - Sayur Nangka -Koloni berwarna putih tersebar tidak merata -bakteri gram positif -bentuk coccus Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2011 Pada tabel kedua tabel di atas, dapat diketahui hasil dari isolasi bakteri. Pada rendang ditemukan sedikit koloni pada cawan petri, jumlah koloni bakteri pada pengenceran 10-3 (pengenceran rendah) sama dengan pada pengenceran 10-4 (pengenceran tinggi) yakni hanya terdapat 3 koloni. Sedikitnya bakteri yang tumbuh pada sampel mungkin disebabkan oleh baiknya kualitas dari bahan pangan (rendang) tersebut, selain itu dapat pula disebabkan oleh perlakuan yang aseptis saat praktikum. Jika dilihat secara visual, koloni bakteri berwarna putih. Namun, setelah dilakukan pewarnaan gram pada kultur murni, didapatkan warna merah yang berarti bakteri ini merupakan bakteri gram negatif. Setelah dilakukan pewarnaan, dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dan terlihat bahwa bakteri tersebut berbentuk basil (batang) dan berwarna ungu kebiruan yang berarti bahwa bakterinya termasuk bakteri gram positif. Berdasarkan ciri-ciri yang telah diuraikan sebelumnya, di duga bakteri yang terdapat pada rendang termasuk jenis Lactobacillus, Bacillus, dan Clostridium. Lactobacillus biasa ditemukan pada permukaan sayuran, bersifat anaerobik fakultatif, dan katalase negatif. Kelompok bakteri ini dapat mensintesis vitamin sehingga banyak digunakan dalam analisis vitamin, dan tahan terhadap suhu pasteurisasi (Fardiaz, 1992). Jenis
Laktobasili heterofermentatif memproduksi gas dan senyawa volatil yang penting sebagai pembentuk citarasa pada makanan fermentasi. Bacillus tumbuh dalam makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan. Selain keracunan makanan dapat juga menimbulkan penyakit dengan gangguan daya tahan tubuh. B.antrachis adalah patogen utama dalam genus ini (Brooks, Geo.F.,dkk: 2001). Termasuk bakteri pembentuk spora, bersifat aerob sampai anaerobik fakultatif, katalase positif dan kebanyakan bersifat gram positif, hanya beberapa bersifat gram variabel (Fardiaz, 1992). Bacillus merupakan bakteri yang banyak ditemukan pada makanan dan lazim terdapat dalam tanah, air, udara dan tanaman. Oleh karena itu, keberadaannya dalam sampel rendang dimungkinkan karena air yang terdapat pada rendang dan kontaminan dari udara. Clostridium bersifat anaerobik sampai mikroaerifilik dan bersifat katalase negatif. Beberapa spesies membentuk spora dengan sporangium yang membengkak pada bagian tengah atau ujung sel. Beberapa spesies Clostridium bersifat patogen dan dapat menyebabkan kebusukan dan keracunan pada makanan. Contohnya adalah Clostridium perfinger yang dapat memproduksi enteritoksin yang dapat menyerang saluran pencernaan den menimbulakan gejala gastrointestinal (Fardiaz, 1992). Sampel selanjutnya adalah Ayam kecap. Pada pengenceran 10-3 (pengenceran rendah) terdapat bakteri sebanyak 3 koloni sedangkan pada pengenceran 10-4 (pengenceran tinggi) terdapat 8 koloni bakteri. Koloni bakteri ini berwarna putih dan tersebar tidak merata jika dilihat secara visual. Namum, setelah dilakukan pewarnaan gram, bakteri yang tumbuh pada ayam kecap ini berwarna merah yang merupakan bakteri gram negatif dan berbentuk spiral. Sayur asam merupakan sampel yang ketiga pada praktikum kali ini, pada pengenceran 10-4 (pengenceran tinggi) di temukan 5 koloni, sedangkan pada pengenceran 10-3 (pengenceran rendah) tidak ditemukan bakteri. Hasil isolasi pada sampel ini tidak tumbuh bakteri, melainkan kapang. Kemungkinan kesalahan yang menyebabkan terjadiya hal ini
adalah pada pengenceran 10-2 suspensi yang diambil dari 10-1 sebanyak 2 ml. Selain itu, praktikum dilakukan tidak secara aseptis sehingga menyebabkan terkontaminasi dengan udara. Sampel yang terakhir dari praktikum ini adalah sayur nangka. Pada pengenceran 10-2 (pengenceran rendah) terdapat bakteri sebanyak 36 koloni sedangkan pada pengenceran 10-3 (pengenceran tinggi) terdapat 5 koloni bakteri. Bakteri yang tumbuh pada sampel ini berbentuk coccus dan berwarna merah yang berarti bahwa bakteri ini bersifat gram positif. Berdasarkan data-data yang diperoleh, maka bakteri yang tumbuh pada sayur nangka ini adalah Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, dan Aerococcus. Bakteri Micrococcus mempunyai suhu optimum pertumbuhan 25 30 0 C, masih dapat tumbuh pada suhu 10 0 C, tetapi tidak dapat tumbuh pada suhu 46 0 C. Bakteri ini ditemukan tersebar di alam, dan banyak ditemukan dalam debu dan air. Bakteri ini juga sering ditemukan pada berbagai bahan pangan segar (Fardiaz, 1992). Kemungkinan ditemukannya bakteri ini dalam sayur nangka adalah dari air yang terdapat dalam sayur nangka tersebut serta kontaminan dari udara. Staphylococcus membutuhkan nitrogen organik (asam amino) untuk pertumbuhannya dan bersifat anaerob fakultatif. Kebanyakan galur Staphylococcus aureus bersifat patogen dan memproduksi enterotoksin yang tahan panas, dimana ketahanan panasnya melebihi sel vegetatifnya (Fardiaz, 1992). Kemungkinan adanya bakteri ini di dalam sayur nangka adalah karena bakteri ini tahan panas, maka bakteri ini tidak mati pada saat proses pengolahan sayur nangka tersebut. Streptococcus merupakan bateri bersifat homofermentatif, dan beberapa spesies memproduksi asam laktat secara cepat pada kondisi anaerobik. Leuconostoc merupakan jenis bakteri yang bersifat heterofermentatif, yaitu memfermentasi gula menjadi asam laktat, CO 2, dan etanol atau asam asetat. Pediococcus bersifat katalase negatif dan mikroaerofilik. Bakteri ini bersifat homofermentatif, sering digunakan dalam fermentasi daging (sosis). Pediococcus cereviseae sering tumbuh
pada pikel, dan menyebabkan kerusakan pada bir dengan memproduksi diasetil dalam jumlah tinggi (Fardiaz, 1992). B. Isolasi Kapang Pertumbuhan kapang dapat berwarna hitam, putih atau berbagai macam warna. Bahan pangan yang banyak mengandung kapang dapat mengakibatkan keracunan apabila termakan oleh manusia. Hal ini diakibatkan karena beberapa jenis kapang selama proses pembusukan pangan atau pertumbuhannya dalam suatu bahan pangan dapat memproduksi racun yang dikenal sebagai mitotoksin. Sebagai suatu kelompok zat, mitotoksin dapat menyebabkan gangguan hati, ginjal dan susunan syaraf pusat dari manusia maupun hewan (Buckle, 1987). Media yang digunakan pada praktikum kali ini adalah PDA (Potato Dextrose Agar) yang memiliki spesifikasi untuk isolasi kapang dan khamir. PDA terdiri atas 200 gram kentang, 15 gram dekstrose dan 1 liter akuades. Langkah-langkah yang dilakukan untuk mengisolasi kapang ini tidak jauh berbeda seperti langkah-langkah untuk megisolasi bakteri yakni praktikum diawali dengan melakukan pengenceran hingga 10-4. Pengenceran yang digunakan untuk mengisolasi kapang adalah pengenceran 10-3 dan 10-4. Hasil dari kedua pengenceran tersebut di tuangkan kedalam cawan petri sebanyak 1 ml, kemudian media PDA dituangkan pada masing-masing cawan petri tersebut. Selanjutnya dilakukan inkubasi. Inkubasi isolat bakteri dengan medium NA dilakukan pada suhu 30 C selama dua hari. Setelah selesai inkubasi, dilakukan perhitungan koloni dengan metode SPC, dan pengamatan di bawah mikroskop. Hasil dari pengamatan kapang dapat dilihat pada tabel 3. Tabel 3. Perhitungan koloni dan SPC pada Kapang Jumlah Koloni Perhitungan Sampel Media 10-3 10-4 SPC 0 Rendang PDA 0 -
Ayam 3 PDA TBUD Kecap Sayur - PDA - Asam Sayur 23 PDA 89 Nangka Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2011 - - 8,9 x 10 4 Berdasarkan data di atas dapat dilihat bahwa tidak terdapat mikroorganisme yang tumbuh pada sampel rendang sehingga tidak dapat dihitung SPC-nya. Hal ini menandakan bahwa rendang tersebut memiliki kualitas dan cara pengolahan yang baik. Selain itu, praktikum dilakukan secara aseptis. Pada pengencaran 10-3 dari sampel ayam kecap ditemukan banyak sekali mikroorganisme sehingga menyebabkan tidak dapat untuk dihitung atau TBUD. Pada pengenceran 10-4 ditemukan kapang sebanyak 3 koloni. Sama halnya dengan sampel rendang, sampel ayam kecap pun tidak dapat dihitung SPC-nya. Pada sample yang ke tiga yaitu sampel sayur asam ditemukan banyak sekali kapang yang sangat banyak sekali dan memenuhi semua ruang pada cawan petri sehingga nilai SPC dari sampel ini pun tidak dapat dihitung. Selain itu, terjadinya hal ini dimungkinkan karena pada saat pengenceran 10-2 suspensi yang diambil dari 10-1 sebanyak 2 ml. Selain itu, praktikum dilakukan tidak secara aseptis sehingga menyebabkan terkontaminasi dengan udara dan pertumbuhan mikroorganisme pada media yang telah disediakan tidak sesuai dengan harapan praktikan. Sampel terkahir dari praktikum ini adalah sayur nangka. Pada pengenceran 10-3 (pengenceran rendah) terdapat 89 koloni kapang sedangkan pada pengenceran 10-4 (pengenceran tinggi) terdapat 23 koloni kapang dan setelah perhitungan maka diperoleh nilai SPC sebesar 8,9 x 10 4 unit koloni/gram. Setelah dilakukan perhitungan SPC, kapang diamat di bawah mikroskop. Hasil pengamatan kapang tersebut dapat dilihat pada tabel 4.
Tabel 4. Hasil Pengamatan Isolasi Bakteri dari Bahan Pangan Sampe Visual Media PDA Bentuk Rendang - Ayam Kecap Miselium berwarna putih, tersebar di pinggiran cawan Sayur Asam Warna spora hitam, Miselium putih tersebar merata Warna spora hitam, warna miselium putih kecoklatan, Sayur Nangka tersebar tidak merata, tumbuh di pinggiran cawan. Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2011 Berdasarkan tabel di atas terlihat gambar kapang yang di amati di bawah mikroskop. Secara visual, pengamatan pada sampel ayam kecap ditemukan miselium kapang berwarna putih dan tersebar di bagian pinggir dari cawan petri, sedangkan pada sayur asam miselium putih tersebar secara merata dan pada sayur nangka miselium kapang berwarna putih kecokelatan, tersebar tidak merata dan tumbuh di bagian pinggir cawan serta spora berwarna hitam. Dugaan kapang yang tumbuh pada ayam kecap adalah jenis Sporotrichum, Thamnidium,dan Aspergillus. Salah satu dari jenis kapang Sporotrichum yaitu Sporotrichum carnis sering ditemukan tumbuh pada daging yang didinginkan dan menimbulkan bintik bintik putih. Selain itu,
salah satu jenis dari kapang Thamnidium yaitu Thamnidium elegans sering tumbuh pada daging yang disimpan pada ruangan pendingin. Aspergillus tersebar luar di alam, dan kebanyakan spesies sering menyebabkan kerukasakan makanan tetapi beberapa spesies digunakan dalam fermentasi makanan. Kapang ini tumbuh baik pada substrat dengan konsentrasi gula dan garam tinggi (Fardiaz, 1992). Kemungkinan ditemukannya kapang janis ini pada ayam kecap karena konsentrasi gula yang tinggi dari ayam kecap. Dugaan kapang yang tumbuh pada sayur asam dan sayur nangka adalah kapang jenis Penicillium. Kapang ini banyak tersebar di alam dan penting dalam mikrobiologi pangan. Kapan ini sering menyebabkan kerusakan pada sayuran, buha-buahan dan serealia (Fardiaz, 1992). Kemungkinan adanya kapang ini pada sayur asam adalah karena dalam sayur asam banyak terdapat berbagai macam jenis sayuran. Sedangkan kemungkinan adanya kapang Penicillium ini dalam sayur nangka adalah karena nangka merupakan buah-buahan sehingga kapang ini tumbuh dan berkembang pada nangka tersebut.
VII. KESIMPULAN Bakteri yang terdapat pada rendang berbentuk basil dan merupakan bakteri gram positif, sedangkan bakteri yang terdapat pada ayam kecap berbentuk spiral dan merupakan bakteri gram negatif. Pada sampel sayur asam tidak tumbuh bakteri karena terkontaminasi. Bakteri pada sayur nangka berbentuk coccus dan merupakan bakteri gram positif. Dugaan bakteri yang tumbuh pada rendang adalah bakteri jenis jenis Lactobacillus, Bacillus, dan Clostridium. Dugaan bakteri yang tumbuh pada sayur nangka adalah bakteri jenis Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, dan Aerococcus. Tidak terdapat kapang yang tumbuh pada rendang. Dugaan kapang yang tumbuh pada ayam kecap adalah kapang jenis Sporotrichum, Thamnidium,dan Aspergillus. Dugaan kapang yang tumbuh pada sayur asam dan sayur nangka adalah kapang jenis Penicillium.
DAFTAR PUSTAKA Brooks,geo.f. 2001. jawetz Melnick,& adelbergs medical microbiology. San Francisco: international. Buckle, K. A., R. A. Edwards, G. H. Fleet, dan Wootton. 1987. Ilmu Pangan. Penerjemah: Hari Purnomo dan Adiono. Universitas Indonesia (UI-Press), Jakarta. Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. PT Gramedia Pustaka Utama : Jakarta. Sumanti, Debby M dkk. 2010. Mikrobiologi Pangan. Penerbit jurusan TIP (FTIP): Jatinangor.