4 II. METODE PENELITIAN 1. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1.1 Materi Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan dari Ordo Siluriformes koleksi Dr. Agus Nuryanto yang disimpan di Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman yang ditangkap di Sungai Cijalu Kabupaten Cilacap (sebagai ingroup), ikan Nemacheilus chrysolaimos dari Ordo Cypriniformes (sebagai outgroup), dan alkohol 70%. 1.2. Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan adalah botol koleksi, bak preparat, sarung tangan, pinset, kertas label, alat tulis, kertas millimeter blok, jangka sorong, jarum preparat, sterofoam, dan kamera digital. 1.3. Lokasi dan Waktu Penelitian Sampel ikan yang diteliti adalah koleksi Laboratorium Taksonomi Hewan yang ditangkap dari Sungai Cijalu Kecamatan Majenang Kabupaten Cilacap. Pengamatan dan pengukuran sampel telah dilakukan di Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto. Penelitian ini diselesaikan selama 5 bulan, dimulai bulan Januari sampai Mei 2014. 2. Metode Penelitian 2.1. Teknik Pengambilan Sampel Penelitian ini menggunakan metode survei dengan teknik pengambilan sampel secara purposive sampling dari koleksi spesimen ikan Ordo Siluriformes Dr. Agus Nuryanto
5 yang disimpan di Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman yang diambil dari Sungai Cijalu Kecamatan Majenang Kabupaten Cilacap. Spesimen yang dipilih hanya individu yang berukuran cukup besar dengan ukuran lebih dari 8 cm dengan alasan untuk memudahkan pengamatan dan identifikasi. Variabel yang diamati meliputi karakter morfologi yaitu (letak mulut, sirip, bentuk garis rusuk, bentuk sirip ekor, tipe sisik, panjang tubuh total, panjang tubuh standar, tinggi badan, tinggi batang ekor), jumlah spesies, jumlah individu per spesies, dan jenis ikan Ordo Siluriformes yang diperoleh dari Sungai Cijalu Kecamatan Majenang Kabupaten Cilacap. Variabel untuk keanekaragaman meliputi jumlah jenis dan jumlah individu per jenis, sedangkan variabel untuk analisis filogenetik meliputi kekerabatan atau hubungan satu ikan dengan ikan yang lain berdasarkan nenek moyangnya. 2.2. Cara Kerja Penelitian 2.2.1. Penyortiran dan Pengawetan Sampel Koleksi ikan yang masih tercampur dalam box plastik dipisahkan dan dikelompokkan berdasarkan kesamaan morfologinya. Ikan dimasukkan ke dalam botol sampel berlabel, kemudian botol diisi larutan alkohol 70% yang baru hingga ikan terendam dan dibiarkan satu malam. Pada hari berikutnya ikan dicuci dan difiksasi kembali menggunakan alkohol 70%. 2.2.2. Pengamatan dan Pengukuran Sampel Sampel yang sudah diawetkan diletakkan di atas millimeter blok yang sudah di laminating dan di bawahnya diberi sterofoam untuk mempermudah penancapan jarum. Posisi kepala ikan berada di sebelah kiri dan sirip ikan dibiarkan dalam posisi normal kemudian diamati karakter morfologinya (lampiran 5).
6 2.2.3. Identifikasi, Determinasi, dan Penentuan Karakter Morfologi Sampel yang diperoleh diidentifikasi dan dideterminasi berdasarkan buku pedoman Taksonomi dan Identifikasi Ikan menurut Kotellat et al. (1993) yang berjudul Freshwater Fishes of Western Indonesian and Sulawesi. Sampel ikan kemudian diamati morfologinya, pada beberapa karakter meliputi sirip, bentuk garis rusuk, bentuk sirip ekor, tipe sisik, letak mulut, panjang tubuh total, panjang tubuh standar, tinggi badan, tinggi batang ekor, jumlah spesies, dan jumlah individu per spesies (Lampiran 4). 2.2.4. Penentuan hubungan kekerabatan Hubungan kekerabatan filogenetik pada spesies ikan yang didapatkan ditentukan dengan urutan kerja sebagai berikut: a. Menentukan Satuan Taksonomi Operasional atau OTU ( Operational Taxonomic Unit) dalam hal ini berupa spesies yang dibandingkan. b. Menyeleksi sifat dan karakter morfologi dari masing-masing spesies yang dapat dibandingkan untuk memberi gambaran secara umum dari ciri satuan taksonomi operasional. Karakter data yang digunakan dalam analisis dapat kuantitatif atau kualitatif. Karakter kuantitatif menunjukkan distribusi kontinyu yang dibagi berdasarkan interval. Karakter kualitatif diklasifikasikan berdasarkan karakter biner atau karakter multistate. Karakter biner (binary characters) memiliki 2 states yang diwakili oleh ada atau tidak ada, artinya apabila terdapat karakter yang diamati diberi angka 1 dan apabila tidak diperoleh diberi angka 0. Karakter multistate (multi-state characters) adalah karakter yang memiliki lebih dari 2 states yaitu 3 states atau lebih, diberi angka 0 apabila spesies memiliki karakter yang pertama, diberi angka 1 apabila
7 spesies memiliki karakter yang kedua, dan diberi angka 2 apabila spesies memiliki karakter yang ketiga. c. Menyusun data hasil pengamatan berupa ciri-ciri morfologi ke dalam bentuk tabel atau matriks untuk semua wakil spesies sampel yang merupakan satuan taksonomi. d. Matriks data tersebut kemudian dianalisis dengan menggunakan metode parsimony (parsimony method) dan melalui software komputer yaitu program PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) versi 4.0.b, untuk menghasilkan matriks similarity atau dissimilarity yang selanjutnya digunakan untuk menghasilkan pohon kekerabatan atau kladogram (Swofford, 2002). 3. Metode Analisis Data ciri morfologi ikan dianalisis secara deskriptif untuk mengetahui deskripsi lengkap masing-masing spesies. Deskripsi lengkap spesies diperoleh setelah semua spesimen ikan diidentifikasi dan dideterminasi berdasarkan Kotellat et al. (1993). Analisis hubungan kekerabatan dilakukan dengan menggunakan metode kladistik dan algoritma maximum parsimony dengan bantuan program PAUP 4.0.b dan hasil disajikan dalam bentuk kladogram atau pohon kekerabatan (Swofford, 2002). Langkah-langkah dalam melakukan analisis filogenetik dan merekonstruksi pohon filogenetik menurut Anonymous (2002) adalah : 1. Membuat hasil pengamatan karakter morfologi dan pemberian skoring untuk tiap karakter. 2. Memindahkan matriks data ke dalam program PAUP dalam bentuk nexus files.
8 3. Menyimpan data dalam posisi yang benar (tidak terdapat kesalahan pemasukkan matriks skoring, sesuai urutan dan karakter yang diamati) dengan ketik nama file dengan menambahkan nex kemudian klik Save. 4. Buka program PAUP. 5. Buka nexus files yang telah disimpan, klik File kemudian klik kembali Open / Execute. 6. Data tersebut dianalisis sampai selesai, kemudian untuk menyimpan pohon ketik Savetrees, pilih Open / Execute. 7. Buka software Treeview (Treev32) untuk membuka pohon kekerabatan atau kladogram yang telah didapatkan. Contoh sebuah pohon filogenetik atau kladogram yang secara skematis menggambarkan hubungan kekerabatan antar takson ( dekat dan jauhnya hubungan kekerabatan antar takson) : Gambar 2.1. Kladogram yang Menunjukkan Hubungan Kekerabatan Keterangan : A : nenek moyang (sebagai outgroup atau pembanding) yang memiliki hubungan kekerabatan terjauh dari turunannya (spesies ingroup). B-E : keturunan (spesies ingroup), dimana hubungan kekerabatannya masih dekat antar spesies. F-G : kelompok monofiletik, dengan F sebagai sister taxa. A-G : nodus terminal H-L : nodus internal 1-4 : Nilai bootstrap pada nodus (mengukur tingkat kepercayaan pada nodus)