BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei 2013 sampai dengan Juni 2013. Lokasi pengambilan sampel rumput laut merah (Eucheuma cottonii) bertempat di Perairan Simpenan, Sukabumi, Jawa Barat. Penelitian karagenan dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Kelautan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Padjajaran. Penelitian uji kolesterol dilakukan di Laboratorium Kimia Organik, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjajaran. Sedangkan pemeliharaan mencit dilaksanankan di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat 1. Blender, pressure cooker, kain saring, dan panci rebus sebagai peralatan pada pembuatan tepung rumput laut; 2. Kandang plastik, botol minuman, dan wadah ransum sebagai alat untuk pemeliharaan tikus; 3. Cool box dan plastik zipper sebagai tempat penyimpanan sampel; 4. Pisau bedah, gunting, papan bedah, syringe, dan toples sebagai peralatan bedah; 5. Neraca analitik, tabung vial 1 ml, beaker glass, mikro pipet, water bath, sentrifuse, cholesterol kit, dan spektrofotometer sebagai peralatan untuk analisis serum. 3.2.2 Bahan 1. 150 gram Eucheuma cottonii yang diperoleh dari Garut; 2. Mencit jantan sebanyak 32 ekor yang berumur 4 minggu dengan selisih berat badan tidak lebih dari 100 gram diperoleh dari Laboratorium Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Padjajaran Bandung; 24
25 3. 3 ml pereaksi reagen kolesterol dengan perbandingann1 : 5 (0,5 N asam sulfat + 0,5 N asam asetat anhidrid) digunakan untuk penentuan kadar kolesterol total; 4. 3 ml pereaksi reagen trigliserida dengan perbandingan 1 : 5 (0,5 N asam sulfat + 0,5 N asam asetat anhidrid untuk penentuan kadar trigliserida; 5. Kolesterol murni; 6. Serum darah; 7. Ransum; 8. Lemak sapi sebagai penambah kolesterol pada pakan mencit; 9. Isopropyl alkohol untuk mengendapkan karaginan; 10. KOH 1% untuk membantu pengendapan karaginan; 11. Akuades untuk perebusan rumput laut 3.3 Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah obvservasi laboratorium yaitu melakukan bioassay secara invivo dengan menggunakan mencit. Mencit dikelompokkan dalam 5 grup perlakuan dengan ulangan sebanyak 3 kali dan sumber kolesterol berasal dari lemak sapi serta pemberian ransum Tepung Karagenan (TK) berdasarkan komposisi menurut AOAC (1984), yaitu grup kelompok kontrol negatif (K1: 0% lemak sapi, 0% TK), grup kontrol positif (K2: 1% lemak sapi, 0% TK), grup A (1% lemak sapi, 5% TK), grup B (1% lemak sapi, 10% TK), dan grup C (1% lemak sapi, 15% TK). 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Pembuatan Karagenan Proses pengolahan karagenan secara umum terdiri dari pencucian, perebusan, penyaringan, pengendapan filtrat dengan isopropilalkohol, pengeringan dan penepungan. Seluruh proses pembuatan tersebut dilakukan selama 3 hari dengan menggunakan 150 gram/hari.berikut ini merupakan tahapan pembuatannya:
26 1. Pencucian Rumput laut yang akan diekstraksi dicuci dan dibersihkan dengan air untuk menghilangkan pasir, garam, kapur, karang, potongan tali dan rumput laut jenis lainnya yang tidak diinginkan. 2. Ekstraksi : Rumput laut yang telah bersih kemudian direbus/diekstraksi dalam air dan larutan KOH 1% 1:15 (150 g rumput laut: 2,25 L ). Perebusan dilakukan selama 2 jam. Rumput laut kemudian dihancurkan sehingga berbentuk bubur rumput laut. 3. Penyaringan : Rumput laut yang lunak dihancurkan dengan blender dan ditambahkan air panas suhu 90 C dengan perbandingan rumput laut dan air 1:15. Hasil disaring dengan kain halus, filtrat diendapkan dengan menambahkan IPA (Isopropil alkohol) dengan perbandingan 1:1,5. 4. Pengendapan : Pengendapan karagenan dilakukan dengan cara menuangkan filtrat ke dalam isopropil alkohol sambil diaduk-aduk dan ditekan, sehingga terbentuk serat karagenan. Perbandingan filtrat dan isopropil alkohol yang digunakan adalah 1:1,5. Serat karagenan yang diperoleh kemudian direndam kembali dengan isopropil alkohol selama 30 menit sehingga diperoleh serat karaginan yang lebih kaku. 5. Pengeringan dan Penepungan : Serat-serat karaginan kemudian dikeringkan di dalam oven dengan suhu 60 C sampai kering, kemudian digiling secara manual tanpa alat sehingga diperoleh tepung karagenan. 3.4.2 Formulasi dan Pemberian Ransum Untuk penelitian bioassay digunakan mencit jantan umur 4 minggu dengan berat 21,3 22 gram. Sebanyak 32 ekor mencit, dipelihara dalam kandang dengan kondisi cahaya terkontrol alami, ventilasi kamar baik dan sesuai suhu kamar. Mencit diberi pakan adaptasi (pakan standar) selama 7 hari (Gambar 6).
27 Gambar 6. Mencit Dalam Kandang Pemeliharaan Pemeliharaan mencit dilakukan selama 38 hari yang dibagi menjadi 3 tahapan kegiatan. Tahapan petama semua mencit diadaptasikan menggunakan ransum standar selama 7 hari. Tahap kedua, mencit menjalani masa peningkatan kolestserol (hiperkolesterolemia) selama 10 hari kecuali kelompok kontrol negatif. Pada masa hiperkolesterolemia jumlah porsi pakan yang diberikan pada perlakuan ini berbeda dengan proses adaptasi, penambahan porsi pakan ditambahkan dengan lemak sapi. Lemak sapi dipanaskan sampai minyak dari lemak tersebut keluar dan dicampurkan dengan pakan yang telah disediakan. Tahap ketiga, yaitu masa perlakuan mencit diberi ransum berbeda sesuai dengan perlakuannya masing-masing. Masa perlakuan berlangsung selama 21 hari (Gambar 7).
28 Gambar 7. Diagram Alir Pelakasanaan Percobaan Pada akhir masa adaptasi dan hiperkolesterolemia kadar kolesterol serum diuji dengan mengambil darah dari 3 ekor mencit yang dipilih secara acak. Setelah tercapai kondisi hiperkolesterolemia mencit dikelompokkan dalam 5 grup perlakuan dan pemberian ransum berdasarkan komposisi menurut AOAC (1984), yaitu grup kelompok kontrol negatif (K1: 0% lemak sapi, 0% TK), grup kontrol positif (K2: 1% lemak sapi, 0% TK), grup A (1% lemak sapi, 5% TK) grup B (1% lemak sapi, 10% TK) dan grup C (1% lemak sapi, 15% TK). Setiap grup perlakuan terdiri dari 5 ekor mencit dengan pemberian ransum selama 3 minggu dan untuk mengetahui aktivitas antikolesterol secara in vivo, hewan uji (mencit) dilakukan pengambilan darah pada awal (hari ke- 0), tengah (hari ke- 10) dan akhir (hari ke- 21) untuk penghitungan total kadar kolesterol dan trigliserida. 3.4.3 Pengambilan Darah Mencit 1. Mencit yang akan diambil darahnya dipindahkan ke dalam suatu toples berukuran besar yang sudah dicampur dengan kloroform (Lampiran 1), tujuannya mencit harus dibuat pingsan terlebih dahulu agar memudahkan dalam proses pengambilan darah. 2. Setelah mencit tersebut pingsan, kemudian dikeluarkan dari toples dan siap untuk diambil darahnya, 3. Bagian perut mencit dibuka kemudian lalu mengambil darah pada bagian jantung, dengan menggunakan jarum suntik 1 ml dengan ukuran 28 gauge. 4. Memasukan sampel darah yamg masih murni kedalam tabung vial berukuran 2 ml (Lampiran 1). 3.4.4 Panen dan Pengambilan Serum 1. Proses panen serum dilakukan karena darah murni yang diambil masih bercampur dengan bagian sel darah yang lain. Proses ini dilakukan
29 dengan menunggu berpisahnya lapisan bening (serum / sel darah putih) yang masih bercampur dengan sel darah selama 1 jam. 2. Setelah 1 jam, dalam tabung akan terbentuk 2 lapisan. Lapisan bawah adalah sel darah merah dan lapisan atas adalah sel darah putih (serum) yang berwarna berning. 3. Serum tersebut diambil dengan menggunakan mikropipet sesuai kebutuhan 4. Serum siap diuji. 3.4.5 Pengukuran Kadar Kolesterol Darah mencit diambil sebanyak mungkin dengan membuka bagian perut mencit, kemudian mengambil darah pada bagian jantung dan menampung kedalam tabung vial 2 ml. Selanjutnya dilakukan proses panen serum (pemisahan sel darah putih) selama 1 jam. Setelah terbentuk 2 lapisan, lapisan bening di bagian atas (serum) diambil dengan mikropipet sebanyak 10 μl. Sampel serum 10 μl ditambah 3 ml larutan pereaksi reagen kit Cholesterol FS, kemudian dicampurkan dan diinkubasikan selama 20 menit pada suhu 20 C. Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 546 nm. 3.4.6 Pengukuran Kadar Trigliserida Darah mencit diambil dengan cara memotong pembuluh darah didaerah leher. Sampel serum 10 μl ditambahkan 1 ml larutan pereaksi reagen trigliserida, kemudian ditampung dengan tabung reaksi lalu didiamkan selama 20 menit. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 546 nm kemudian serumnya dipisahkan untuk pengukuran trigliseridanya. 3.5 Parameter Yang Diamati 3.5.1 Nilai Rendemen
30 Untuk mengetahui nilai rendemen karagenan yang dihasilkan, maka perhitungan dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Keterangan: Berat akhir = Berat hasil akhir pembuatan karagenan (gram) Berat awal = Berat rumput laut kering (gram) 3.5.2 Kadar Kolesterol Menurut Retnaningsih (2008) kadar kolesterol dihitung dengan rumus: konsentrasi_standar Keterangan : Δ standar = 546 nm Konsentrasi standar (kolesterol murni) = 200 mg.dl -1 3.5.3 Kadar Trigliserida Menurut Retnaningsih (2008) kadar trigliserida dihitung dengan rumus sebagai berikut: konsentrasi_standar Keterangan : Δ standar = 546 nm Konsentrasi standar (trigliserida murni) = 200 mg. dl -1 3.6 Analisis Data Data yang didapat dari hasil perhitungan total kolesterol dan trigliserida, dianalisis secara deskriptif dan disajikan dalam bentuk gambar, tabel dan grafik.
31