14 3. METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan Maret 2012 dengan selang waktu pengambilan satu minggu. Lokasi pengambilan ikan contoh memiliki ketinggian tempat yang berbeda, yaitu di Balai Pelestarian Perikanan Perairan Umum (BPPPU) Ciherang, Cianjur dengan ketinggian 800 meter diatas permukaan laut (dpl) dan kolam budidaya di daerah Rancabungur, Kabupaten Bogor dengan ketinggian 300 meter diatas permukaan laut (dpl). Analisis sampel dilakukan di Laboratorium Unit Rehabilitasi dan Reproduksi (URR), Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Gambar 5. Peta lokasi penelitian
15 3.2. Metode Kerja 3.2.1. Analisis laboratorium secara makroskopis Pengambilan contoh ikan lele sangkuriang dilakukan terhadap 12 ekor ikan dalam kondisi hidup, selanjutnya dilakukan penimbangan bobot ikan dan pengukuran panjang ikan menggunakan penggaris berketelitian 0,1 cm. Setelah itu ikan dibedah, gonad ikan diambil dan ditimbang bobotnya menggunakan timbangan digital dengan ketelitian 0,01 g. Semen dikeluarkan dari gonad dengan cara ditoreh pada salah satu sisi tanpa mengenai pembuluh darah dan semen tersebut ditampung di dalam cawan petri. Gonad yang dilakukan analisis hanya gonad yang memiliki kondisi yang normal dan simetris. Setelah semua semen dikeluarkan, volume semen pada gonad kiri dan kanan diukur dengan menggunakan syringe, kemudian ph semen pada gonad kanan dan kiri diukur menggunakan kertas ph indikator dengan kisaran 6,4-8,0. Konsistensi diukur dengan cara memiringkan cawan petri dan dilihat apakah semen bersifat kental, sedang, atau cair (Arifiantini 2012). 3.2.2. Analisis laboratorium secara mikroskopis 3.2.2.1.Motilitas spermatozoa Penilaian gerakan individu (motilitas) spermatozoa harus dilakukan pengenceran terlebih dahulu, yaitu satu tetes semen diambil dan diletakkan pada object glass. Larutan pengencer (air) ditambahkan, kemudian kedua larutan tersebut dihomogenkan. Satu tetes campuran larutan diambil dan tutup dengan cover glass. Penilaian motilitas dilakukan dengan menggunakan lensa objektif pembesaran 400 kali dengan melihat persentase motilitas spermatozoa dan kecepatan spermatozoa bergerak ke depan (Arifiantini 2012). 3.2.2.2.Kosentrasi spermatozoa Penilaian konsentrasi spermatozoa menggunakan counting chamber, yaitu semen yang akan dihitung konsentrasinya diencerkan terlebih dahulu menggunakan larutan formol saline dengan perbandingan 1:1000 (1 µl semen : 999 µl pengencer). Semen dihisap menggunakan mikropipet, kemudian ujung luar dari mikropipet tersebut dilap dengan tisu untuk membuang spermatozoa yang menempel pada mikropipet tersebut dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 2 ml yang telah berisi formol saline. Larutan dihomogenkan dengan membuat putaran
16 seperti angka 8 selama 2-3 menit. Setelah itu, counting chamber disiapkan dan ditutup menggunakan gelas penutup khusus. Sebanyak 8-10 µl semen yang telah diencerkan kemudian dimasukkan ke dalam counting chamber. Spermatozoa yang berada di dalam counting chamber dihitung dari 5 kotak besar yang berada dalam counting chamber, yaitu 4 kotak pada bagian sudut dan 1 bagian tengah (Arifiantini 2012). 3.2.2.3.Morfologi dan morfometri Pengamatan morfologi dan morfometri spermatozoa dengan membuat preparat ulas, kemudian dilakukan pewarnaan dengan menggunakan pewarnaan Carbol fuchsin (Williams). Adapun langkah-langkah dalam pewarnaan Williams disajikan pada Lampiran 3. Pada pengamatan morfometri spermatozoa dilakukan dengan melihat diameter kepala dan panjang ekor spermatozoa menggunakan mikroskop pada perbesaran objektif 100 kali dan perbesaran okuler 8 kali. Setiap satu sampel ikan diukur diameter kepala dan panjang ekor spermatozoa sebanyak 30 sel spermatozoa (Arifiantini 2012). 3.2.3. Pengamatan kondisi lingkungan Pengamatan kondisi lingkungan berupa pengukuran kualitas, yaitu pengukuran DO, ph air, dan suhu air mengacu pada standar APHA (2005). 3.2.4. Analisis data 3.2.4.1.Uji normalitas (Uji Kolmogorov-Smirnov) Uji Kolmogorov-Smirnov digunakan untuk mengetahui distribusi nilai-nilai sampel yang teramati sesuai dengan distribusi teoritis tertentu (normal, uniform, poisson, atau eksponensial). Prinsip dari uji Kolmogorov-Smirnov adalah menghitung selisih absolut antara fungsi distribusi frekuensi kumulatif sampel [S N (X)] dan fungsi distribusi frekuensi kumulatif teoritis [F 0 (X)] pada masingmasing interval kelas (www.biostatistik.com). D maksimum = F 0 (X) S N (X)
17 F 0 (X) = distribusi kumulatif pilihan di bawah H 0 S N (X) = distribusi kumulatif pilihan hasil observasi Uji normalitas (Kolmogorov-Smirnov) juga dapat dilakukan dengan menggunakan Software Minitab versi 15. Hipotesis yang digunakan, yaitu H0 : data yang digunakan merupakan data distribusi normal dan H1 : data yang digunakan data distribusi tidak normal. Jika p-value <0,05 maka tolak H0 (data menyebar tidak normal), sedangkan jika p-value >0,05 maka gagal tolak H0 (data meyebar normal). 3.2.4.2.Uji parametrik (Uji-t) Uji-t merupakan uji statistik yang digunakan untuk menguji kesamaan ratarata dari dua populasi yang bersifat independen pada taraf nyata 0,05. Nilai uji statistik dapat dihitung dengan menggunakan rumus: Jumlah data pertama Jumlah data kedua Ragam data pertama Ragam data kedua Ragam populasi Rata-rata data pertama Rata-rata data kedua 3.2.4.3.Uji non-parametrik (Uji Mann-Whitney) Uji Mann-Whitney merupakan uji non-parametrik yang digunakan untuk menguji apakah dua sampel yang independen berasal dari populasi yang sama. Perhitungan uji Mann-Whitney dapat menggunakan Software Minitab versi 15 atau dapat menggunakan rumus:
18 Jumlah data pada populasi 1 Jumlah data pada populasi 2 Jumlah ranking pada populasi 1 Jumlah ranking pada populasi 2 Uji Mann-Whitney juga dapat dilakukan dengan menggunakan Software Minitab versi 15. Hipotesis yang digunakan, yaitu H0 : data pertama = data kedua dan H1 : data pertama data kedua. Jika p-value <0,05 maka tolak H0, sedangkan jika p-value >0,05 maka gagal tolak H0. 3.2.4.4.Konsentrasi spermatozoa Cara menghitung konsentrasi spermatozoa adalah jumlah sel spermatozoa dari 2 chamber dijumlahkan, kemudian dirata-ratakan (chamber 1 + chamber 2 = N/2) (Arifiantini 2012). Rumus dalam menghitung jumla spermatozoa per ml: Jumlah Spermatozoa/ml = N x 5 x FP x 10.000 N : Jumlah rata-rata spermatozoa dalam chamber. FP : Faktor pengenceran (1000). 5 : Faktor koreksi karena hanya menghitung 5 kotak dari 25 kotak hitung yang ada (25/5). 10.000 : Faktor koreksi yang dibutuhkan karena kedalaman cover slip 0,0001 ml per chamber 3.2.4.5.Morfometri spermatozoa Pengukuran morfometri spermatozoa didapat dari hasil pengukuran menggunakan mikrometer yang sudah dikonversikan kedalam satuan mikron (µ) dengan melakukan kalibrasi terlebih dahulu menggunakan stage mikrometer. Setelah dilakukan kalibrasi didapat hasil bahwa satu skala pada mikrometer okuler sama dengan 1,47 µm, sehingga: Diameter kepala & panjang ekor = hasil skala pada mikrometer x 1,47