30 BAB III METODE PENELITIAN A. Rancangan Penelitian Rancangan penelitian ini adalah observasional analitik. Observasi dilakukan dengan pendekatan cross sectional dimana hanya diamati satu kali dan pengukuran subjek dilakukan pada saat pemeriksaan tersebut. Peneliti ingin mengetahui perbedaan rasio ekspresi RANKL/OPG sebagai variabel bebas dan destruksi tulang sebagai variabel terikat. B. Tempat dan Waktu Penelitian 1. Tempat penelitian a. Poliklinik THT RSUD Dr Moewardi Surakarta untuk mendapatkan sampel penelitian. c. Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret dan RSUD Dr Moewardi Surakarta. d. Bagian Radiologi RSUD Dr. Moewardi Surakarta 2. Waktu penelitian Pengambilan sampel dimulai bulan Desember 2015 sampai bulan Maret 2016.
31 C. Populasi Populasi penelitian adalah semua pasien OMSK yang datang berobat ke poliklinik THT RSUD Dr. Moewardi, Surakarta berdasarkan hasil anamnesis, pemeriksaan fisik dan pemeriksaan penunjang. Selanjutnya pasien dilakukan operasi mastoidektomi. D. Sampel Penelitian Subjek penelitian adalah semua pasien OMSK yang datang berobat ke poliklinik THT RSUD dr. Moewardi, Surakarta yang memenuhi kriteria penelitian dan selanjutnya dilakukan operasi untuk pengambilan jaringan granulasi. Kriteria inklusi : 1. Laki-laki atau perempuan 2. Pasien yang sudah didiagnosis OMSK tipe benigna dan maligna menjalani tindakan operasi mastoidektomi untuk pengambilan jaringan mukosa kavum timpani Kriteria eksklusi : 1. Pasien OMSK dengan penyakit keganasan kepala leher 2. Pasien OMSK dengan penyakit diabetes melitus tergantung insulin 3. Pasien OMSK dengan penyakit autoimun.
32 E. Besar Sampel Penentuan besar sampel berdasarkan uji hipotesis dengan menggunakan koefisien korelasi (r) (Sopiyudin, 2010): n = (Zα+ Zβ ) 2 + 3 0,5 In [(1+r)/(1-r)] Keterangan : α : Kesalahan tipe I. Tingkat kemaknaan 95%, maka berarti α = 0,05 sehingga Zα = 1,960 β : Kesalahan tipe II Power = 1 - β = 1 20% = 80%, maka berarti β = 0,20 sehingga Zβ = 0,842 r : Koefisien korelasi = 0,61 (Kuczkowsky et al., 2010) ln : Logistik natural n = (1,96+ 0,842 ) 2 + 3 0,5 In [(1+0,61)/(1-0,61)] n = 16 + 3 = 19 Dari perhitungan diatas, sampel yang diperlukan sebanyak 19 orang ditambah antisipasi perkiraan drop out 10% maka jumlah sampel adalah 22 orang pasien OMSK.
33 F. Teknik Pengambilan Sampel Pengambilan sampel dilakukan dengan tehnik consecutive sampling (non probability sampling) yaitu semua subjek yang datang dan memenuhi kriteria pemilihan dimasukkan dalam penelitian sampai besar sampel yang diperlukan terpenuhi. G. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas (variabel independent) : Ekspresi RANKL dan OPG 2. Variabel terikat (variabel dependent) : Destruksi tulang pada OMSK H. Definisi Operasional 1. Ekspresi RANKL dan OPG a. Definisi : Ekspresi RANKL adalah ekspresi protein pada permukaan membran sel mukosa telinga tengah yang irreversibel. Ekspresi OPG adalah ekspresi protein pada permukaan membran sel mukosa telinga tengah yang irreversibel. Rasio ekspresi RANKL/OPG adalah perbandingan ekpresi RANKL dan OPG. b. Alat ukur : Imunohistokimia c. Cara ukur : Imunoreaktivitas antibodi RANKL antihuman dan OPG antihuman d. Skala ukur : numerik
34 e. Hasil ukur : nilai positif warna kecoklatan Hasil yang diperoleh dinyatakan dalam Intensity Distribution Score (IDS). Berdasarkan penilaian intensitas warna, hasil pengecatan imunohistokimia digolongkan menjadi 3 yaitu intensitas kuat nilainya 3 berwarna coklat tua, intensitas sedang nilainya 2 berwarna coklat muda, intensitas lemah nilainya 1 berwarna kuning keemasan, dan negatif nilainya 0 berwarna biru-ungu. Penilaian prosentase dilaksanakan secara manual dengan mikroskop cahaya oleh seorang ahli Patologi Anatomi. Untuk nilai IDS yang diperoleh dari perhitungan sel, masingmasing slide dinilai dari sembilan lapang pandang dan diambil nilai reratanya. Setelah itu dilakukan penghitungan penentuan skor IDS dengan menggunakan rumus : IDS = (3 x %IK) + (2 x %IS) + (1 x %IL) + (0 x % IN) (Barresi et al., 2011) Keterangan : IDS : Intensity Distribution Score IK : Intensitas positif kuat dengan warna coklat tua IS IL : Intensitas positif sedang dengan warna coklat muda : Intensitas positif lemah dengan warna kuning keemasan IN : Intensitas negatif dengan warna biru 2. Destruksi tulang pada OMSK a. Definisi : destruksi tulang yang diakibatkan oleh infeksi pada OMSK b. Alat ukur : CT Scan mastoid dan atau temuan pada saat operasi
35 c. Cara ukur : Tingkat destruksi tulang ditentukan oleh dokter spesialis THT-KL sebagai operator mastoidektomi. Tingkat destruksi tulang ditentukan sebagai berikut : Tingkat 0 : tidak ada destruksi tulang Tingkat 1 : destruksi pada skutum dan osikel Tingkat 2 : destruksi pada tegmen dan seluruh osikel Tingkat 3 : destruksi pada tegmen, seluruh osikel, kanalis fasialis, dinding liang telinga, sinus sigmoid, koklea, dan dinding tulang mastoid. d. Hasil ukur : Ordinal. I. Alat dan Bahan Penelitian Alat penelitian yang dipakai pada penelitian ini yaitu : 1. Alat pemeriksaan THT yaitu : lampu kepala, otoskop, aplikator. 2. Set instrumen tindakan operasi mastoidektomi (ME) dengan mikroskop operasi PBS formalin dan botol untuk menyimpan jaringan biopsi. 3. Bahan jaringan diambil dari mukosa kavum timpani dan antrum mastoid hasil operasi mastoidektomi. 4. Bahan untuk pewarnaan jaringan dengan teknik imunohistokimia antara lain antibobi sekunder IgG anti mouse yang dirangkai dengan HRP, antibodi mouse monoclonal antibody anti human RANKL dan OPG 5. Alat untuk pengecatan imunohistokimia : mikrotom, poly L-Lysine glass slide (SIGMA), termometer, mounting media (Canada Balsem), microwave oven,
36 inkubator, pipet mikro, deck glass, stop watch, humidified chamber dan ruangan dalam kondisi kelembaban tinggi. 6. Mikroskop OLYMPUS seri BX 41 untuk pemeriksaan IHC. J. Cara Kerja Pasien OMSK yang memenuhi kriteria inklusi dilakukan MSCT-scan kemudian dilakukan operasi mastoidektomi dengan bantuan mikroskop operasi. Pada pasien OMSK tipe maligna, jaringan kolesteatoma diambil di lapisan perimatrik. Jaringan yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi PBS formalin. Spesimen jaringan dikirim ke Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Dr. Moewardi Surakarta untuk dilakukan blok parafin. Selanjutnya blok parafin dipotong dengan mikrotom setebal 4 mikron. Hasil potongan jaringan diletakkan pada slide dan digunakan untuk pemeriksaan ekspresi RANKL dan OPG. Hasil potongan jaringan dilakukan pengecatan imunohistokimia sebagai berikut : 1. Hasil potongan jaringan diletakkan pada slide poly-l-lysine dan selanjutnya dinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 malam (agar lebih merekat pada slide). 2. Deparafinisasi : - Direndam dalam xylol I selama 5 menit - Direndam dalam xylol II selama 5 menit - Direndam dalam xylol III selama 5 menit - Direndam dalam xylol IV selama 5 menit - Direndam dalam alkohol absolut selama 5 menit
37 - Direndam dalam alkohol 95% selama 5 menit - Direndam dalam alkohol 70% selama 5 menit - Dicuci dengan aquadest selama 5 menit 3. Retrival antigen dilakukan pada microwave oven dengan buffer sitrat ph 6,4 pada suhu sedang selama 2 menit dan kemudian dilanjutkan pada suhu rendah selama 1 menit. 4. Dicuci dengan PBS selama 2 X 5 menit. 5. Tahapan quencing endogenous peroxidase yaitu dengan memasukkan slideslide tersebut ke dalam metanol H2O2 0,3% selama 30 menit. 6. Dicuci kembali dengan aquades/pbs 2 X 5 menit. 7. Langkah-langkah selanjutnya ini dilakukan dalam humidified chamber : a. Diberikan blocking reagent dan dibiarkan selama 30 menit. Kemudian dicuci dengan aquadest / PBS 2 x 5 menit. b. Ditambahkan antibodi primer yang telah dilarutkan dalam antibodi diluents ( 1:50 ), dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruang atau dalam kulkas pada suhu 4 o C selama 18 jam. Kemudian dicuci dengan aquadest / PBS selama 2 x 5 menit. c. Ditambahkan antibodi sekunder berlabel biotin dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 30 o C, lalu dicuci dengan aquadest atau PBS 2 x 5 menit. d. Ditambahkan substrat DAB (diamino benzidine), ditunggu selama 5 menit, lalu cuci dengan aquadest / PBS 2 x 5 menit.
38 e. Dilakukan perwarnaan counterstaining dengan hematoxcylin Mayer selama 30 detik dan kemudian dicuci dengan air mengalir selama 2 5 menit f. Selanjutnya ditempelkan pada obyek glass dengan perekat Canada Balsem. 8. Masing-masing sampel diamati dengan mikroskop cahaya dan dievaluasi pada sembilan lapang pandang dengan sebaran yang merata, kemudian dibuat reratanya. K. Etika Penelitian Surat persetujuan penelitian diperoleh dari Komisi Etik Penelitian Kedokteran, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta/RSDM Surakarta. L. Analisis data Semua data dianalisis dengan program SPSS 21 for windows. Data selanjutnya diuji secara statistik dengan menggunakan uji korelasi Spearman. Data deskripsi karakteristik subjek yang mendukung berupa nominal diuji menggunakan uji chi square, sedangkan data ordinal menggunakan uji Mann-Whitney. Derajat hubungan antara kedua variabel dikatagorikan sangat kuat jika korelasi 0,800-1,000, kuat jika korelasi 0,600-0,799, sedang jika korelasi 0,400-0,599, lemah jika korelasi 0,200-0,399, sangat lemah jika korelasi 0,000-0,199.
39 M. Alur Penelitian Populasi Penelitian Kriteria Inksklusi Kriteria Eksklusi ` OMSK tipe benigna dan maligna Hasil CT Scan dan atau temuan operasi Tingkat 0 Tingkat 1 Tingkat 2 Tingkat 3 Ekspresi RANKL dan OPG Ekspresi RANKL dan OPG Ekspresi RANKL dan OPG Ekspresi RANKL dan OPG Rasio RANKL/OPG Rasio RANKL/OPG Rasio RANKL/OPG Rasio RANKL/OPG Analisis