ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DALAM BATANG TANAMAN Artemisia Annua L. YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA TERHADAP Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus Skripsi Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi ( S. Farm. ) Program Studi Farmasi Oleh : Antonius Alfian Yuan Dias Priharta NIM : 038114064 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008
Skripsi ISOLASI DAN II}ENTTFIKASI BAKTERI ENDOFTT DALAM BATANG TANAMAN Artemisia AnnuaL. YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA TERHADLP Eschericia co# DAN Staphylococcus aureils Iliajukan Oleh : Antonius Alfian Yuan Dias Priharta NIM:038114064 Telah disetujui oleh: Pembimbing: ', o{ i t ^,s I(','u!L--' Maria Dwibudi Jumpowati, S.Si. Tanggaf,?1..fov.*.,.i..*g.o8 (, III
Pengesahan Skripsi Berjudul: ISOLASI DA}{ IDENTIFIKASI BAKTERI ENIX}FTT DALAM BATANG TANAMAN Artemisis Anw* L YAITG DIUJI POTENSI ANTIBAKTEilNYA TERAD AP Exhefcia coli DAlt Staphytoeorus sursus OIetr Antonius Alfian Yuan Dias Priharta NIM:038114S64 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Slripsi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Pada tanggal : 15 Januari 3008 Mengetahui Fakultas Farmasi Dharma Pembimbing: *r.rt., urt. MariaDwi Budi Jumpowafi, S.Si. Panitia Pengr$i : 1. Mari*Dwi Budi Jumpowati, S.Si. 2. Y*stina Sri Hartini, M.Si., Apt. 3. Igl Y" Kristio Budiasmoro, M.Si. Tanda Tangan 0&v 44,, YTw r 1Y
Skripsi ini dipersembahkan untuk : Yesus Kristus Bapak Bernardinos Dias Sidharta Ibu Caecilia Enita Amarwati Crezensia Alfiora Dea Dema Dias Oktabenita Felisita Anesti Kusumastuti Without Love, I m Nothing.... v
LEMBAR PER}IYATAA}{ PENSETilJUAI{ PUBLIKASI KARYA ILMIAH T]NTUK KEPEI{TINGAI\I AI{ADEMIS Yaag bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universias Sanata Dharma : Nomor lrdahasiswa : 038114064 : Antonius Alfian Yuan Dias hihffa Deui pengembangan ilmu pengetahuan, saya meilbtrikar ke,pada Perpustakaaa Universitas Sanah Dharma karya ilmiah saya yang berjudtl : "ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAIffSRI ENDOFIT DAI,AM BATAFIG TANAMAN Artenisin an $til L. YAFIG IIIUJI POTENSI ANTIBAI(IERIIYYA TERIIADAP Escheria cotri DAF{ Str,phyloeweets asteuf beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memkrikm k pada Perpusakaan Universitas Sanata Dharua bak unt* mcnyimparq mengnlihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bsh* pang*alan data memdisribusikan s cara terbatas, dan merrpublikasikannya di Internet dau media tain untr* kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari $lya malryut mcrrberikan rcyalti kepada saya selama t tap mencatrfimkm nama saya s*agai pmulis. Derrikian psmyafaan ini yang saya buat dengru sebenarnya. Dibnatdi Yoryaka*a Padatanggal : 30 Jauuari 2008 Yrnn Dias Priharta)
PRAKATA Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus yang telah melimpahkan berkat, kesabaran, kekuatan, dan karunia-nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi yang penulis susun berjudul ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DALAM BATANG TANAMAN Artemisia Annua L. YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA TERHADAP Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Pada kesempatan ini tidak lupa penulis mengucapkan banyak terimakasih kepada : 1. Tuhan Yesus Kristus yang telah memberi rahmat dan berkat-nya serta perlindungan dan bimbingan-nya pada setiap umat-nya. 2. Bapak, Ibu, dan adik Dhea atas doa, kasih sayang, perhatian, dan dukungannya baik moril maupun materiil yang selalu diberikan padaku. 3. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si., selaku dosen pembimbing utama yang telah memberikan bimbingan, pengarahan, waktu, kesabaran, dan saran hingga skripsi ini dapat tersusun. 4. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan saran dan masukan kepada penulis. 5. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan saran dan masukan kepada penulis. 6. Pihak BPTO Tawangmangu, terutama Bapak Agus. Terimakasih telah vi
membantu dalam pengadaan dan determinasi tanaman Artemisia annua L. 7. Eyang Putri beserta keluarga besar di Klaten, terimakasih atas doa, perhatian, kasih sayang, nasehat, dan dukungan untukku. 8. Pakdhe dan Budhe beserta keluarga, terutama Budhe Erlin, terimakasih atas perhatian, nasehat, dan dukungan untukku. 9. Felisita, terimakasih untuk doa, perhatian, cinta, kesabaran, serta dukungan yang sangat berkesan untukku. 10. Pak Kartatmo, Pak Mukmin, Mas Narto selaku Staff Sekretariat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, terimakasih telah membantu dalam memperlancar administrasi hingga tersusunnya skripsi ini. 11. Mas Sarwanto, Mas Sigit, Mas Wagiran selaku Laboran Laboratorium Biologi Farmasi, terimakasih atas semua bantuannya selama ini. 12. Teman-teman kelompok C 2003 : Anien, Siska, Eveline, Hartono, Komang, Indhu, Devi, Titien, Ratna, Yulia, Madya, Punto, Esti, Tata, Budi, Rosa, Vera, Ratih, dan Maria. Terimakasih atas kerjasama dan kebersamaannya selama ini. Che 03 Never Die... 13. Anak-anak kontrakan : Abang Aan, Hengky, Manto, Irwan, Ndaroe, Topan, dll. Thanks untuk kebersamaaannya. Keep the Spirit.. 14. Anak-anak No Label cabang Teknik Sipil Atma Jaya, thanks untuk kebersamaaannya. Tetap semangat mengejar wanita sampai Nirwana.. 15. Teman-teman KKN USD XXXIII Gantiwarno Kelompok 29 : Mbak Non (PBI), Valent (MIPA), Melinda (Psi), Sandra (S.Ing), Ika (P.Mat), Dika (IKOM), Punto (PBI), dan Bu Parlan selaku Ibu Pondokan, terimakasih atas vii
bantuan, dukungan dan kebersamaannya selama ini. 16. Lukas Eko, teman skripsi Rosa, dan Bayu (PBI), terimakasih atas kerjasama, bantuan, dan kebersamaannya selama ini. 17. Yoyok, thanks telah membawakan tanaman Artemisia annua L. dari Tawangmangu sampai ke Jogja. 18. Teman-teman angkatan 2003 yang tidak mungkin saya sebutkan satu persatu, terimakasih atas kebersamaannya selama ini. 19. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis hingga tersusunnya skripsi ini. Penulis sangat menyadari bahwa dalam skripsi ini masih banyak terdapat kesalahan dan kekurangan, oleh karena itu saran dan kritik yang sifatnya membangun sangat penulis harapkan demi kesempurnaan penulisan ini. Akhirnya penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu farmasi pada khususnya dan kemajuan ilmu pengetahuan pada umumnya. Yogyakarta, 21 November 2007 Hormat penulis Antonius Alfian Yuan Dias Priharta viii
PER}IYATAAH KEASLIAN PENELITIAI{ Saya menyatakan dengan sesuagguhnya bahwa slcripsi yang saya ftrlis tm tidak memuat karya atau bgian karya orang lain, kecuali yarrg tetah disebrskan dalam daftar pustaka sebgaimana layaknya karyailmiah. Yogyakarfa, 21 November 2007 Antonius YuanDias Prihsrra tx
INTISARI Tanaman Artemisia annua L. merupakan tanaman yang digunakan sebagai obat anti malaria. Pada tanaman A.annua L ini diketahui ada mikrobia endofit yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar (Simanjuntak dkk, 2004). Mikrobia endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Mikrobia endofit diketahui dapat memperbaiki pertumbuhan tanaman karena kemampuannya menekan pertumbuhan mikrobia-mikrobia patogen dengan cara kompetisi, menghasilkan senyawa antibiotik, atau menginduksi ketahanan tanaman (Pudaritadesantamaria, 2004). Tujuan penelitian ini adalah mengetahui adanya isolat bakteri endofit dalam batang tanaman A.annua L., menguji potensi antibakteri dari isolat bakteri endofit tersebut terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus serta mengetahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri tersebut. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif-deskriptif. Isolasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L. dilakukan dengan metode streak plate, potensi antibakteri diuji dengan metode paper disc. Identifikasi bakteri endofit dilakukan dengan pengamatan morfologi koloni, morfologi sel, dan uji biokimia. Hasil dari penelitian ini adalah senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman A.annua L. mempunyai potensi antibakteri terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus, serta diketahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri tersebut adalah genus Amphibacillus. Kata kunci : Bakteri endofit, zona hambat, Artemisia annua L., Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Amphibacillus. x
ABSTRACT Artemisia annua. L. is a plant which is used as antimalaria. At this A.annua. L. is known that is endophytic mikrobia forming colony in tissue at stem area until root (Simanjuntak et al, 2004). Endophytic mikrobia grew in vascular tissue from the plant (Stone et al, 2000). Endophytic microbia can fix up the development of the plant because its ability to suppress the pathogenic development in survival way, producing antibiotic compounds, or inducting the vurnability of the plant (Pudaritadesantamaria, 2004). The purpose of this research was to find the endophytic bacteria isolate toward Eschericia coli and Staphylococcus aureus, and to find the identity of the endophytic bacteria which produced this antibacteria compounds. This result was pure experimental research and it was an explorative descriptive research. The endophytic bacteria isolation from A.annua. L. s stem was used streak plate method, the antibacterial potential was tested using paper disc method. The identification of endophytic bacteria was using colony morphology observation, cell morphology, and biochemical test. The result of this research were an antibacterial compounds which was produced by endophytic bacteria was isolated from A.annua. L, had the potential antibacteria to E.coli and S.aureus, and it was known that the identity of the endophytic bacteria which produced this antibacteria compounds was Amphibacillus. Key words : endophytic bacteria, inhibition zone, Artemisia annua L., Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Amphibacillus. xi
DAFTAR ISI Halaman Judul... ii Halaman Persetujuan Pembimbing... iii Halaman Pengesahan... iv Halaman Persembahan... v Prakata... vi Pernyataan Keaslian Karya... ix Intisari... x Abstract... xi Daftar Isi... xii Daftar Tabel... xvi Daftar Gambar... xvii Daftar Lampiran... xviii BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang... 1 1. Permasalahan... 3 2. Keaslian Penelitian... 3 3. Manfaat Penelitian... 4 B. Tujuan Penelitian... 4 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA A. Antibiotik... 5 B. Mikrobia Endofit... 7 xii
C. Artemisia annua L.... 10 D. Rekombinasi Genetik... 12 E. Bakteri Uji... 14 F. Metode Pengujian Potensi Senyawa Antimikrobia... 16 G. Identifikasi Mikrobia... 18 H. Keterangan Empiris... 21 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian... 23 B. Variabel dan Definisi Operasional... 23 C. Bahan dan Alat Penelitian... 25 D. Tahapan Penelitian... 28 1. Determinasi tanaman Artemisia annua L.... 28 2. Pengumpulan batang Artemisia annua L.... 28 3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)... 28 4. Disinfeksi Batang Artemisia annua L.... 31 5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium... 31 6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate... 32 7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit Terhadap E.coli dan S.aureus Secara Difusi Paper disc... 32 8. Identifikasi Bakteri Endofit... 33 xiii
E. Analisis Hasil... 40 BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L.... 43 2. Pengumpulan Batang Tanaman Artemisia annua L.... 43 3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)... 44 4. Disinfeksi Batang Tanaman Artemisia annua L.... 46 5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium... 47 6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate... 49 7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit kode B dan kode D Terhadap S.aureus dan E.coli Secara Difusi Paper disc... 52 8. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji S.aureus... 54 9. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji E.coli... 59 10. Identifikasi Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D... 63 a. Pengamatan Morfologi Sel Isolat Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D... 64 b. Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D... 71 c. Uji Biokimia... 73 xiv
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan... 85 B. Saran... 85 DAFTAR PUSTAKA... 86 LAMPIRAN... 90 BIOGRAFI PENULIS... 102 xv
DAFTAR TABEL Tabel I. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam... 56 Tabel II. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam... 57 Tabel III. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam... 60 Tabel IV. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam... 61 Tabel V. Hasil Uji Biokimia Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D... 82 Tabel VI. Hasil Identifikasi Bakteri Endofit kode B, Bakteri Endofit kode D, dan Bakteri Genus Amphibacillus... 84 xvi
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Skema Kerja Penelitian... 42 Gambar 2. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam... 55 Gambar 3. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam... 57 Gambar 4. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam... 60 Gambar 5. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam... 61 Gambar 6. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode B... 65 Gambar 7. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode D... 66 Gambar 8. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode B... 67 Gambar 9. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode D... 68 Gambar 10. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode B... 69 Gambar 11. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode D... 70 xvii
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi Tanaman A.annua L... 90 Lampiran 2. Tanaman A.annua L... 92 Lampiran 3. Isolasi Bakteri Endofit pada MS Medium dengan Waktu Inkubasi 3 hari... 92 Lampiran 4. Isolasi Kembali Bakteri Endofit dengan Metode Streak Platting dengan Waktu Inkubasi 24 Jam... 93 Lampiran 5. Hasil Uji Motilitas Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Medium Semi Solid... 93 Lampiran 6. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Nutrient Broth... 94 Lampiran 7. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Nutrient Agar Tegak... 94 Lampiran 8. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Nutrien Agar Miring... 95 Lampiran 9. Hasil Uji Asam sulfida (H 2 S)... 95 Lampiran 10. Hasil Uji Dekarboksilasi Lisin... 96 Lampiran 11. Hasil Uji Indol... 97 Lampiran 12. Hasil Uji Methylen Red (MR)... 97 Lampiran 13. Hasil Uji Sitrat... 98 Lampiran 14. Hasil Uji Katalase... 99 Lampiran 15. Hasil Uji Oksidase... 99 xviii
Lampiran 16. Hasil Uji Gelatin... 100 Lampiran 17. Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) tanpa Paraffin... 100 Lampiran 18. Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) dengan Paraffin... 101 xix
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Antibiotik merupakan substansi yang dihasilkan oleh mikrobia yang dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan atau membunuh mikrobia lain. Setiap antibiotika mempunyai aktivitas penghambatan hanya terhadap kelompok mikrobia tertentu yang disebut spektrum penghambatan (Suwandi, 1989) Pada tanaman A.annua L ini diketahui bahwa ada mikrobia endofit yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar, dari hasil identifikasi diketahui bahwa mikrobia tersebut adalah Bacillus polymixa (Simanjuntak, Bustanusallam, Malini, Otovina, Rahayuningsih, & Said, 2004). Bacillus polymixa termasuk dalam genus Bacillus yang mempunyai ciri sel berbentuk batang, gram positif, fakultatif anaerob, membentuk endospora, motil, dan bersifat katalase positif (Holt, Krieg, Sneath, Staley, & Williams, 2000). Mikrobia endofit adalah mikrobia yang hidup di jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya. Mikrobia endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone, Bacon, White, 2000). Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit. Mikrobia endofit tersebut mampu menghasilkan metabolit sekunder yang diduga sebagai transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit
2 (Tan & Zou, 2001). Kemampuan mikrobia endofit memproduksi metabolit sekunder yang sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrobia endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut (Radji, 2005). Bakteri endofit Bacillus polymixa hasil isolasi dari tanaman A.annua L., dapat memproduksi metabolit artemisinin yang sangat potensial sebagai anti malaria (Simanjuntak, dkk, 2004). Pada isolasi mikrobia endofit, diperlukan media yang dapat menyokong pertumbuhan tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli, Scannerini, Bertea, & Maffei, 2001). Media Murashige-Skoog (MS) merupakan media yang digunakan untuk hampir semua macam tanaman karena mengandung konsentrasi garamgaram mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO 3 - dan NH 4 + (Hendaryono,1994). Staphylococcus aureus dapat menghemolisis darah dan mengkoagulasi plasma, juga menginfeksi bisul, impetigo, dan infeksi luka yang menimbulkan nanah. Eschericia coli dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, terjadinya diare, sepsis, dan meningitis. (Jawetz, Melnick, & Adelberg, 1996). S.aureus (gram positif) dan E.coli (gram negatif) dipilih untuk mengetahui keefektifan potensi antibakteri dari senyawa yang dihasilkan oleh bakteri endofit terhadap bakteri gram positif dan gram negatif, sehingga dapat diketahui spektrum penghambatan dari senyawa antibakteri tersebut. Jan G. Bruhn dan Lars Bohlin pada tahun 1997 memperkenalkan molecular pharmacognosy, yang mendifinisikan pharmacognosy sebagai
3 pengetahuan molekuler yang menyelidiki hubungan struktur dan aktifitas dari bahan-bahan alam dengan potensinya sebagai obat. Bahan-bahan alam yang berpotensi sebagai obat dapat menjadi model atau prekursor dalam penemuan obat baru (Samuelsson, 1999). Untuk memperoleh antibiotik baru perlu dilakukan pencarian sumber penghasil antibiotik (Suwandi, 1989). Oleh karena itu, eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif untuk mendapatkan senyawa antibiotik baru. (Simanjuntak, dkk, 2004). 1. Permasalahan Dari latar belakang yang telah diuraikan di atas, permasalahan yang muncul dalam penelitian ini adalah : a. Apakah bakteri endofit dapat diisolasi dari batang A.annua L.? b. Apakah senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari batang A.annua L. mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus? c. Bagaimana identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus tersebut? 2. Keaslian Penelitian Sejauh penelusuran pustaka dan jurnal belum pernah dilakukan penelitian tentang isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L. yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S aureus. Penelitian isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A annua L yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus dilakukan bersama dengan Rachmawati (2007). Perbedaan dari penelitian bersama ini adalah digunakan bakteri uji yang berbeda, di mana Rachmawati (2007)
4 menggunakan bakteri uji Bacillus subtilis dan Salmonella thypii. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dalam batang A.annua L. yang memiliki potensi antibakteri. b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat menemukan isolat bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri yang dapat mendukung bidang kefarmasian dan mampu memberikan informasi tentang senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri endofit sebagai model atau prekursor dalam rangka penemuan obat baru di masa yang akan datang. c. Manfaat metodologis Metode yang digunakan dalam penelitian ini dapat digunakan dan terus dikembangkan dalam usaha pencarian bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri. B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk: 1. Mengisolasi bakteri endofit dalam batang A.annua L. 2. Menguji potensi senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari batang A.annua L. terhadap E.coli dan S.aureus. 3. Mengetahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus tersebut.
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Antibiotik Antibiotik didefinisikan sebagai produk metabolit yang dihasilkan oleh organisme tertentu, yang dalam konsentrasi rendah bersifat merusak atau menghambat mikrobia lain. Dengan kata lain, antibiotik merupakan zat kimia yang dihasilkan oleh suatu mikrobia yang dapat menghambat mikrobia lain (Pelczar & Chan, 1988) Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri, yang mempunyai khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan mikrobia, sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Turunan zat tersebut yang dibuat secara semi-sintetis termasuk kelompok ini, begitu pula senyawa sintesis dengan khasiat antibakteri lazimnya disebut antibiotik (Pelczar & Chan, 1988). Terjadinya resistensi mikrobia yang tadinya peka terhadap antibiotika dapat terjadi melalui mutasi pada kromosomnya atau pertukaran materi genetik di antara mikrobia. Pertukaran materi kromosomal sangat jarang, yang banyak terjadi adalah pertukaran materi genetik ekstrakromosomal, baik berupa plasmid konjugatif ataupun plasmid non konjugatif. Secara biokimiawi, resistensi bakteri terhadap antibiotika dapat terjadi melalui mekanisme: (i). Berkurangnya permeabilitas mikrobia terhadap obat, (ii). inaktifasi antibiotika oleh enzim yang dihasilkan bakteri, (iii). modifikasi reseptor obat, (iv). meningkatnya sintesa senyawa yang antagonistik terhadap obat (Sjahrurachman, 1996)
6 Resistensi mikrobia terhadap antibiotika akibat perubahan permeabilitas dapat terjadi akibat perubahan pada reseptor obat, penurunan kapasitas transpor obat dan perubahan struktur dinding sel. Mekanisme ini merupakan mekanisme tersering dalam hal resistensi terhadap tetrasiklin dan sulfonamida. Resistensi bakteri karena modifikasi obat secara enzimatik banyak ditemukan terhadap antibiotika beta-laktam, kloramfenikol dan aminoglikosida. Enzim-enzim yang memodifikasi antibiotika tersebut dapat disandi oleh gen kromosom maupun gen ekstrakromosom, misalnya pada Staphylococcus yang resisten terhadap penisilin G, menghasilkan β laktamase yang merusak obat tersebut (Jawetz dkk, 1996). Resistensi bakteri terhadap antibiotika karena perubahan reseptor dapat ditemukan pada resistensi terhadap streptomisin. Telah diketahui bahwa pada bakteri yang resisten, ribosomnya berbeda dibandingkan dengan bakteri yang sensitif terhadap streptomisin. Hal ini disebabkan terjadinya mutasi noktah satu asam amino pada ribosom 30S. Dampak klinis resistensi tipe ini tidak begitu penting karena sifatnya tidak menyebar. Contoh lain resistensi jenis ini adalah resistensi terhadap penisilin pada bakteri Neisseria gonorrhoeae sebagai akibat perubahan pada penicillin binding protein (PBP) (Sjahrurachman, 1996). Bahan-bahan alam telah sejak lama digunakan untuk pengobatan. Bahan alam meliputi segala organisme seperti tanaman, hewan, dan mikroorganisme. Obat-obat modern yang digunakan pada masa kini sekitar 40 persennya berasal dari bahan-bahan alam. Obat-obatan dari bahan alam tersebut termasuk juga jenis obat-obat penting seperti glikosida jantung, morfin, dan antibiotik. Beberapa jenis antibiotik merupakan turunan dari bahan-bahan alam yang struktur kimianya telah
7 dimodifikasi untuk menghasilkan senyawa dengan efek farmakologis yang diinginkan (Samuelsson, 1999). B. Mikrobia Endofit Mikrobia endofit adalah mikrobia yang hidup di dalam jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya (Radji, 2005). Mikrobia endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Jaringan vaskular (pembuluh) terdapat di seluruh tubuh tanaman, mengangkut zat-zat antara akar dan tunas (Campbell, Reece, Mitchell, 2002). Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit (Tan & Zou, 2001). Kemampuan mikrobia endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrobia endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut (Radji, 2005). Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikrobia endofit yang terdiri dari bakteri atau fungi (Strobel & Daisy, 2003). Sehingga apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat dapat menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman
8 aslinya untuk diambil sebagai simplisia, yang kemungkinan memerlukan waktu yang relatif lama untuk dipanen (Radji, 2005). Mikrobia endofit meningkatkan adaptasi ekologi inangnya dengan menaikkan toleransi mereka pada stress lingkungan (lingkungan yang kurang menguntungkan) dan juga menaikkan resistensi inangnya terhadap fitopatogen dan atau herbivora termasuk serangga yang memakan tanaman inang. Mikrobia endofit juga dapat melindungi inangnya dari serangan bakteri atau fungi patogen dari lingkungan disekitarnya (Tan & Zou, 2001). Berbagai jenis mikrobia endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya, dan telah berhasil dibiakkan dalam medium pembenihan yang sesuai. Demikian pula metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikrobia endofit tersebut dapat diisolasi dan dimurnikan serta dielusidasi struktur molekulnya (Radji, 2005). Beberapa penelitian terkait dengan mikrobia endofit yang berpotensi sebagai antibiotik telah dilakukan. Cryptocandin adalah antifungi yang dihasilkan oleh mikrobia endofit Cryptosporiopsis quercina yang berhasil diisolasi dari tanaman obat Tripterigeum wilfordii, dan berkhasiat sebagai antifungi yang patogen terhadap manusia yaitu Candida albicans dan Trichopyton spp. (Strobel, Miller, Miller, Condron, Teplow, & Hess, 1999). Phomopsiahalasin merupakan metabolit yang diisolasi dari mikrobia endofit Phomopsis spp.berkhasiat sebagai antibakteri Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, dan dapat juga menghambat pertumbuhan fungi Candida tropicalis (Horn, Simmonds, Schartz, & Blaney, 1995). Antibiotik berspektrum luas yang disebut munumbicin
9 dihasilkan oleh endofit Streptomyces spp. strain NRRL 30562 yang merupakan endofit yang diisolasi dari tanaman Kennedia nigriscans, dapat menghambat pertumbuhan Bacillus anthracis dan Mycobacterium tuberculosis yang multiresisten terhadap berbagai obat anti TBC (Castillo et al, 2002). Ditinjau dari hubungan tersebut, mikrobia endofit berpotensi untuk digunakan pada pengobatan modern, pertanian, dan industri. Fungi dan bakteri adalah mikrobia yang paling umum membentuk koloni pada jaringan tanaman, yang selanjutnya disebut mikrobia endofit (Strobel & Daisy, 2003). Endofit umumnya tidak ditemukan pada organ yang spesifik tetapi kebanyakan spesies mikrobia endofit diisolasi dari batang dan juga dari daun (Anonim, 2005). Untuk mengidentifikasi suatu jenis mikrobia perlu dilakukan isolasi untuk memperoleh biakan murni. Menurut Pelczar & Chan (1986) setiap koloni yang berlainan mewakili macam mikrobia yang berbeda sehingga hal ini dapat digunakan untuk melakukan isolasi suatu mikrobia. Untuk mengisolasi mikrobia di bawah kondisi laboratorium perlu disediakan nutrien dan kondisi fisik yang akan memenuhi persyaratan tipe mikrobia tertentu yang sedang ditelaah. Sejalan dengan hal tersebut, berbagai macam medium digunakan di dalam mikrobiologi, dikombinasikan dengan berbagai kondisi fisik untuk inkubasi (Pelczar & Chan, 1986). Banyak prosedur untuk isolasi mikrobia endofit yang relatif mudah dan biasa digunakan oleh orang yang terlatih dalam dasar teknik mikrobiologi. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit. Endofit tidak menunjukkan tanda- tanda keberadaan mereka sehingga sulit dideteksi dan
10 hanya dapat diteliti dengan menggoreskan secara hati- hati permukaan jaringan yang telah dibersihkan dengan etanol dan NaOCl (pemutih). Penambahan dan waktu untuk pencelupan dalam NaOCl beragam sesuai dengan jaringan dari inang (Anonim, 2005). Mikrobia endofit dapat diisolasi dari permukaan jaringan tanaman yang telah dibersihkan dan ditumbuhkan pada medium pertumbuhan yang sesuai. Pada isolasi mikrobia endofit, diperlukan medium yang dapat menyokong pertumbuhan tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli, Scannerini, Bertea, & Maffei, 2001). Medium Murashige-Skoog (MS) merupakan medium yang digunakan untuk hampir semua macam tanaman karena mengandung konsentrasi garam-garam - mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO 3 dan NH + 4 (Hendaryono, 1994). Jaringan tanaman yang dikultur memerlukan unsur hara makro dan unsur hara mikro dari dalam medium tumbuh, dari dalam medium kultur juga harus ada bahan-bahan lain yang berguna untuk merangsang pertumbuhan serta perkembangan sel jaringan yang dikulturkan. Pemisahan eksplan dari tanaman induk menyebabkan perubahan biosintesa dalam tanaman tersebut, sehingga pemberian unsur hara kedalam medium kultur untuk membantu eksplan supaya dapat tumbuh dan berkembang. Bahan-bahan itu adalah bahan organik yang meliputi karbohidrat, vitamin, asam amino, serta zat yang mengatur pertumbuhan (Katuuk, 1989) C. Artemisia annua L. Tanaman A.annua termasuk Familia Asteraceae ; Genus Artemisia ; Spesies Artemisia annua L. Mempunyai nama daerah : Anuma (Irian Jaya);