PEMERIKSAAN DARAH HENDRA WIJAYA 1
DAFTAR ISI 1. Penentuan Kadar Glukosa Darah... 1 2. Penentuan Kadar Kolesterol Darah Metode Liebermann-Burchard... 3 3. Penentuan Kadar Kreatinin Darah... 5 4. Penentuan Kadar Hemoglobin Darah: Metode Sahli... 7 5. Penentuan Kadar Hemoglobin Darah: Metode Warna... 8 6. Penetapan Nilai Hematokrit: Metode Wintrobe... 9 7. Penetapan Nilai Hematokrit: Mikrometode... 10 8. Penetapan Laju Endapan Darah: Metode Wintrobe... 11 9. Penetapan Laju Endapan Darah: Metode Westergren... 12 10. Penentuan Kadar Kalsium Darah: Metode Clark & Collib... 13 11. Penentuan Kadar Fosfor (P) Darah: Metode Briggs... 14 12. Penentuan Konsentrasi Fosfor (P) Darah modifikasi... 16 1
1. Penentuan Kadar Glukosa Darah Prinsip: Filtrat darah bebas protein yang mengandung gula direaksikan dengan larutan kupritartrat dalam suasana basa. Ion kupri akan direduksi oleh gula menjadi kupro dan mengendap sebagai Cu 2 O. Dengan menambahkan pereaksi fosfomolibdat maka Cu 2 O akan melarut lagi dan warna larutan akan menjadi biru tua, karena adanya oksida Mo. Ekstingsi dari larutan akan diukur pada panjang gelombang 660 nm dengan spektrofotometer. Dengan menggunakan hukum Lambert Beer dapat ditentukan kadar gula dalam sampel. A kadar gula darah = A sampel s tan dar C s tan dar Pereaksi Larutan kupritartrat alkalis Larutan Fosfomolibdat Larutan standar glukosa 0.1 dan 0.2 mg/ml Larutan H 2 SO 4 0.67 N Larutan Na-wolframat 10% Cara Kerja Pipet 1 ml darah ke dalam Erlenmeyer kecil, tambahkan 7 ml akuades, 1 ml Na-wolframat 10%, dan 1 ml H 2 SO 4 0,67 N (tetes demi tetes). Campurkan baik-baik, biarkan 10 menit saring dengan kertas saring dan siapkan 3 tabung Folin Wu. Isilah ketiga tabung tersebut dengan campuran sebagai berikut: No Bahan Tabung a Tabung b Tabung c 1 Filtrat 1 ml - - 2 Standar glukosa - 1 ml - 3 Akuades - - 1 ml 4 Kupritartrat 1 ml 1 ml 1 ml 1
Panaskan ketiga tabung dalam air mendidih selama 8 menit tepat Kemudian dinginkan, encerkan dengan 7 ml akuades Kemudian tambahkan 1 ml fosfbmolibdat pada setiap tabung Baca intensitas warnanya pada panjang gelombang = 660 nm 2
2. Penentuan Kadar Kolesterol Darah Metode Liebermann-Burchard Uji lipid darah yang paling sering dilakukan ialah uji terhadap kolesterol total, triasilgliserol (trigliserida), dan kolesterol HDL. Konsentrasi kolesterol LDL biasanya diperoleh melalui perhitungan. Konsentrasi kolesterol darah yang meningkat adalah salah satu faktor yang meningkatkan risiko terjadinya aterosklerosis, yaitu terbentuknya plak aterosklerosis yang mengandung ester kolesterol dan kalsium pada dinding arteri, dan infark otot jantung (myocardial infarct,mi). Risiko tersebut akan makin meningkat bila disertai oleh meningkatnya konsentrasi trigliserida darah, faktor risiko yang lain ialah: tekanan darah tinggi (hipertensi), kegemukan (obesitas), merokok, perilaku tipe A, dan kurang olahraga. Konsentrasi kolesterol dan trigliserida darah yang tinggi dapat diturunkan melalui pengelolaan pola makan yang rendah lemak dan rendah kolesterol. Namun pada kasus yang cukup berat tetap harus dibarengi dengan pemberian obat penurun kadar kolesterol darah. Prinsip: Kolesterol di dalam ekstrak kloroform akan bereaksi dengan asam asetat anhídrida dan asam sulfat pekat memberikan reaksi warna serapannya dapat diukur dengan spektrofotometer. Pereaksi: larutan alkohol:eter (3:1), H 2 SO 4 pekat, asam asetat anhidrida, standar kolesterol 0.4 mg/ml, kloroform Cara Kerja: 1. Masukkan 12 ml campuran alkohol eter ke dalam tabung sentrifus 15 ml 2. Ambil 0.2mL serum/plasma darah dan masukkan ke dalam campuran tadi dengan perlahan-lahan. 3. Tutup tabung rapat-rapat dan kocoklah baik-baik (bila ada, dengan Vortex) selama 1 menit; diamkan selama 30 menit. 4. Sentrifus selama 3 menit, gunakan sentrifus klinis (kecepatan rendah). 3
5. Lakukan dekantasi: tuang supernatan ke dalam gelas piala 50 ml, uapkan supernatan di dalam penangas air mendidih hingga mengering. 6. Ekstraksi residu dengan kloroform 2 kali: gunakan 2-2.5 ml kloroform tiap kali ekstraksi, kocok perlahan dan tuangkan ekstrak ke dalam tabung berskala. 7. Cukupkan volume hingga 5 ml dengan menambahkan kloroform. 8. Siapkan 3 tabung reaksi dan isilah dengan larutan sebagai berikut. Bahan A S R Ekstrak kloroform 5 ml - - Standar - 5 ml - Kloroform - - 5 ml As.asetat anhídrida 2 ml 2 ml 2 ml H 2 SO 4 pekat 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 9. Kocok tiap tabung, simpan di ruang gelap selama 15 menit 10. Ukur serapannya =גpada 420 nm 4
3. Penentuan Kadar Kreatinin Darah Bila terjadi gangguan pembentukan air kemih atau bahkan sama sekali tidak dapat dikeluarkan, akan terjadi peningkatan beberapa senyawa yang terdapat di dalam plasma darah. Umumnya senyawa itu berupa molekul berukuran kecil dan mengandung nitrogen dan lazim disebut 'unsur-unsur nitrogen nonprotein' plasma atau serum darah. Adapun unsur nitrogen nonprotein yang mungkin meningkat kadarnya pada gangguan fungsi atau penyakit ginjal, terutama ialah yang berasal dari urea dan kreatinin, dan kadang-kadang asam urat. Dalam hal ini asam urat bukan menjadi dasar penentuan primer diagnosis gangguan fungsi ginjal. Demikian pula nitrogen dari urea (N-urea) di dalam darah sesungguhnya kadarnya dipengaruhi oleh hal-hal yang tidak terkait dengan fungs ginjal atau ekskresi air kemih melainkan oleh laju katabolisme protein. Konsumsi makanan berprotein tinggi atau pengaruh homon steoid adrenal akan meningkatkan laju katabolisme protein sehingga akan meningkatkan kadar ureum dalam darah. Petunjuk yang lebih tepat bagi fungsi ginjal justru pengukuran kadar kreatinin darah. Kreatinin merupakan senyawa buangan yang terbentuk di dalam jaringan otot ketika senyawa energi tinggi kreatin fosfat (fosfokreatin) bereaksi dengan ADP membentuk kreatin dan ATP, sebagian kecil kreatin fosfat akan kehilangan fosfatnya dan membentuk kreatinin. Kreatinin dibuang melalui air kemih dan jumlah yang dibuang setiap harinya tidak dipengaruhi oleh menu makanan, umur, jenis kelamin, atau latihan fisik. Kreatinin yang muncul pada filtrat glomerulus tidak akan diserap baik oleh tubula ginjal, sehingga semua kondisi yang menurunkan laju filtrasi glomerulus akan mengakibatkan berkurangnya ekskresi kreatinin keluar tubuh dan mengakibatkan peningkatan jumlahnya di dalam darah. Prinsip : Setelah protein darah diendapkan, filtrat yang mengandung kreatinin bereaksi dengan larutan asam pikrat basa membentuk warna kemerahan. Reaksi ini disebut rekasi Jaffe dan tidak khas untuk kreatinin; akan tetapi 80-90% warna yang hasilkan dalam reaksi ini disebabkan oleh adanya kreatinin. Senyawa 5
nonkreatinin lain yang bereaksi menghasilkan warna yang sama dengan pikrat basa antara lain: Keton, glukosa dan asam karbonat. Pereaksi: asam pikrat jenuh, NaOH 10%, kreatinin standar 0.005 mg/ml. Campurkan 15 ml asam pikrat jenuh dengan 3 ml NaOH 10% untuk membuat asam pikrat basa. Dibuat 15 menit sebelum dipakai. Cara Kerja: 1. Siapkan serum/plasma bebas protein (filtrat Folin Wu) sebagai berikut: Bahan Air bebas ion H 2 S0 4 2/3 N Na-wolframat 10% Darah Jumlah 14 ml 2 ml 2 ml 2 ml Campurlah baik-baik lalu saring: filtrat yangdiperoleh adalah contoh yang akan diperiksa kadar kreatininya (Anu). 2. Kerjakan dalam 3 tabung kimia masing-masing untuk Anu (A). Standar (S) dan Blanko (B) sebagai berikut: Bahan A S B Filtrat 5 ml - - Standar - 5 ml - Air bebas ion - - 5 ml Asam pikrat basa 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml Campur baik-baik; biarkan selama 20 menit, lalu baca pada 540 =ג nm. Kadar Kreatinin dalam contoh A = RA/RS 6
4. Penentuan Kadar Hemoglobin Darah Metode Sahli Tujuan: menentukan kadar hemoglobin dalam darah menurut metode Sahli. Bahan dan alat: Standar warna, HC1 0,1 N, aquadest, alkohol 70 %. lanset jarum tusuk "Franke" hemoglobinometer Sahli yang terdiri dari : pipet Sahli dan penyedotnya, tabung Sahli dan pengocok. Cara kerja: 1. Isi tabung Sahli dengan larutan HC1 0,1 N sampai angka 10 dalam tabung. 2. Tusuk ujung jari yang sudah dicuci dengan alkohol 70 %, kemudian isap darah melalui pipet Sahli sampai batas garis 20 mm 3 3. Bersihkan pipet, kemudian segera masukkan darah ke dalam tabung Sahli, biarkan selama 3 menit agar terbentuk hematin asam yang berwarna coklat. 4. Tambahkan akuades tetes demi tetes sambil diaduk, sampai warnanya sama dengan standar (yang ada di sebelah kiri dan kanan tabung) 5. Baca tinggi permukaan cairan pada tabung Sahli. Pembacaan langsung dengan melihat pada jalur gr % yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 ml darah. Jalur laimiya pada tabung Sahli (bila ada), menunjukkan % hemoglobin yang dihitung dibandingkan dengan hemoglobin normal (tabungnormal dipakai 15,6 gr %). 7
5. Penentuan Kadar Hemoglobin Darah Metode Warna Tujuan : menentukan kadar hemoglobin dalam darah menurut metode warna Prinsip : Hemoglobin + sianida + Ferrisianida --------------- Sianomethamoglobin Prosedur: Panjang gelombang : 520-560 nm Spektrofotometer : 546 nm Kuvet : Diameter dalam 1 cm Suhu inkubasi : 20-25 C (suhu kamar) Pengukuran terhadap akuades Pipetkan ke dalam tabung reaksi: Larutan 3 % : 5 ml Darah : 0,02 ml Pipet dibersihkan dengan cara beberapa kali menyedot dan mengeluarkan. Larutan dicampur dengan baik dan diinkubasi pada suhu 20-25 c C paling cepet setelah 3 menit dan paling lambat setelah 24 jam ekstinsi sample diukur terhadap akuades. Konsentrasi Hemoglobin dalam darah dapat dihitung dengan rumus : C= 36.77 x E (g/l00 ml) atau C= 22.82 x E (mmol/l) (Hb/4) 8
6. Penetapan Nilai Hematokrit Metode Wintrobe Nilai hematokrit ialah voluma semua eritrosit dalam 100 ml darah dan disebut dengan % dari voluma darah itu. Biasanya nilai itu ditentukan dengan darah vena atau darah kapiler. 1. Isilah tabung Wintrobe dengan darah Oxalat, heparin atau EDTA sampai garis tanda 100 di atas. 2. Masukkanlah tabung itu ke dalam sentrifuge yang cukup besar, pusinglah selama 30 menit pada kecepatan 3000 rpm. 3. Bacalah hasil penetapan itu dengan memperhatikan: a. Warna plasma diatas: warna kuning itu dapat dibandingkan dengan larutan kaliumbichromat dan intensitasnya disebut dengan satuan. Satu satuan sesuai dengan warna kaliumbichromat 1:10000. b. Tebalnya lapisan putih di atas sel-sel merah yang tersusun dari leukosit dan trombosit (buffy coat). c. Voluma sel-sel darah merah. 9
7. Penetapan Nilai Hematokrit Mikrometode 1. Isilah tabung mikrokapiler yang khusus dibuat untuk penetapan mikrohematokrit dengan darah. 2. Tutuplah ujung satu dengan nyala api atau dengan bahan penutup khusus. 3. Masukkanlah tabung kapiler itu ke dalam sentrifuge khusus yang mencapai kecepatan besar, yaitu lebih dari 16 000 rpm (sentrifuge mikrohematokrit). 4. Pusinglah selama 3-5 menit. 5. Bacalah nilai hematokrit dengan menggunakan grafik atau alat khusus. Catatan Padatnya kolom eritrosit yang didapat dengan memusing darah ditentukan oleh faktor: radius sentrifuge, kecepatan sentrifuge dan lamanya pemusingan. Dalam sentrifuge yang cukup besar, dengan memakai makrometode dicapai kekuatan pelantingan (relative centrifugal force) sebesar 2 260 g. Untuk memadatkan sel-sel merah dengan memakai sentrifuge itu diperlukan rata-rata 30 menit. 10
8. Penetapan Laju Endapan Darah Metode Wintrobe 1. Dengan memakai pipet Wintrobe, masukkan darah oxalate atau darah EDTA kedalam tabung Wintrobe setinggi garis tanda 0 mm. Jagalah jangan sampai terjadi gelembung atau busa 2. Biarkan tabung Wintrobe dalam posisi tegak lurus pada satu tempat yang tak banyak angin selama 60 menit 3. Bacalah tingginya lapisan plasma dengan millimeter dan laporkanlah angka itu sebagai laju endap darah. 11
9. Penetapan Laju Endapan Darah Metode Westergren 1. Ambillah secara akseptis 0,4 ml larutan Natriumsitrat 3,8% steril 2. Ambillah darah sebanyak 1,6 ml dan dicampurkan dengan larutan Natriumsitrat dalam tabung sehingga diperoleh 2 ml larutan. 3. Isaplah darah itu kedalam pipet Westergen sampai garis bertanda 0 mm kemudian biarkan pipet itu dalam posisi tegak lurus dalam rak Westergen selama 60 menit 4. Bacalah tingginya lapisan plasma dengan millimeter dan laporkan hasilnya sebagai laju endap darah. 12
10. Penentuan Kadar Kalsium Darah Metode Clark & Collib Prinsip : Kalsium diendapkan langsung dari plasma/serum dengan amonium oksalat membentuk endapan kalsium-oksalat. Endapan dicuci dengan amonia encer lalu dititrasi menggunakan kalium permanganat. Pereaksi: amonium oksalat 4%, amonia 25%, asam sulfat 1N, kalium permanganat 0,01 N setara dengan 0,2 mg Ca Cara Kerja: 1. Siapkan dua buah tabung sentrifus untuk blanko (B) dan sampel Anu (A) sebagai berikut: Bahan Blanko A Serum - 2 ml Akuadest 4 ml 2 ml Amonium oksalat 1 ml 1 ml 2. Aduk pakai pengaduk kecil hingga terbentuk endapan. 3. Biarkan selama 30 menit. 4. Sentrifus tabung tersebut selama 5 menit pada kecepatan rendah (1500 rpm). 5. Buang cairan dan letakkan tabung terbalik di atas kertas saring selama 10 menit; keringkan cairan di mulut tabung dengan kertas saring 6. Masing-masng tabung ditambahkan ammonia 2% sebanyak 3 ml. lalu aduk dan kocok setelah itu disentrifuse lagi. Kegiatan tersebut dilakukan 2 kali seperti diatas. 7. Masing-masing tabung ditambahkan dengan H2SO4 1N sebanyak 2 ml. Aduk dengan pengaduk sampai endapan larut dan masukkan ke dalam penangas air 70C lalu titrasi dengan KMnO4 sampai titik akhir larutan berwarna merah jambu 8. Kadar kalsium normal dalam darah: 8.10-10.40 (mg/100 ml). Perhitungan: Kadar Ca = (A-B) x 0,2 x 100/2 mg% = (A-B) x 10 mg % 13
11. Penentuan Kadar Fosfor (P) Darah Metode Briggs Prinsip : Protein diendapkan terlebih dahulu dengan larutan TCA. Filtrat yang diperoleh akan memiliki ph rendah sehingga reaksinya dengan asam molibdat membentuk senyawa kompleks. Kompleks ini kemudian direduksi oleh larutan hidrokuinon membentuk warna biru. Untuk menstabilkan warna digunakan Na-tiosulfat 20%. Serapan diukur dengan spektrofotometer Pereaksi: asam molibdat, TCA 20%, Na-tiosulfat 20%, hidrokuinon 0,5%, Fosforstandar 0,01 mg/ml Cara Kerja: 1. Siapkan filtrat yang akan dianalisis dalam tabung kimia sebagai berikut: Bahan Serum Akuades TCA 20% Jumlah 2 m L 6 ml 2 ml 2. Aduk hati-hati dan biarkan selama 10 menit. 3. Saring memakai kertas saring kering; selanjutnya filtrat dikerjakan sebagai berikut: Bahan Anu Standar Blanko Filtrat 5 ml - - Standar P - 3 ml - Molibdat 2 ml 2 ml 2 ml Hidrokuinon 1 ml 1 ml 1 ml Na-tiosulfat 20% 1 ml 1 ml 1 ml Akuades 1 ml 3 ml 6 ml 14
4. Campur baik-baik dengan cara membolak-balik tabung yang mulutnya ditutup dengan kertas plastik bersih. 5. Simpan dalam ruang gelap selama 30 menit. 6. Bacalah dengan spektrometer 15
12. Penentuan Konsentrasi Fosfor (P) Darah modifikasi Pereaksi: asam molibdovanadat, TCA 5%, HCI 5M, Fosfor standar 1 mg/ml Cara Kerja: 1. Siapkan reagen campuran yang terdiri atas satu bagian volume larutan molibdovanadat dan satu bagian volume HCI 5M. 2. Siapkan larutan fosfor standar dalam beberapa konsentrasi, dari10-200 µg per ml. 3. Siapkan filtrat yang akan dianalisis sebagai berikut: Pipet 1 ml serum, lalu tambahkan 4 ml TCA 5% dan segera kocok dengan menggunakan Vortex dan lanjutkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit Ambil supematan dengan pipet sebanyak 2 ml. 4. Selanjutnya kerjakan filtrat dan larutan standar sebagai benkut: Bahan Anu Syandar Blanko Fitrat 2 ml - - Standar P - 2 ml - Akuades 6 ml 6 ml 8 ml Kocoklah setiap tabung segera setelah ditambahkan Reagen campuran 2 ml 2 ml 2 ml 5. Bacalah pada panjang gelombang 400nm 16