A. Isolasi Mikrobia merupakan proses pemisahan mikrobia dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan harus diketahui cara-cara penumbuhan mikrobia pada media biakan dan syarat-syarat yang diperlukan (faktor nutrisi dan kebutuhan oksigen) Hal-hal yang harus diperhatikan dalam isolasi mikrobia: 1. sifat-sifat spesial mikrobia yang diisolasi 2. Tempat hidup atau asal mikrobia 3. Medium pertumbuhan yang sesuai 4. Cara menanam dan inkubasi mikrobia
5. Cara menguji mikrobia hasil isolasi (biakan murni) 6. Cara memelihara mikrobia hasil isolasi agar tetap berupa biakan murni Isolasi Bakteri a. Cara goresan (streak plate method) suspensi bahan yang mengandung bakteri, digoreskan pada medium agar (Nautrien agar) dalam petridish. Inkubasikan sehingga pada bekas goresan tumbuh koloni-koloni bakteri. Lakukan isolasi lebih lanjut untuk masing-masing koloni yang tumbuh. b. Cara taburan (pour plate method) inokulasikan medium agar yang sedang mencair pada suhu 50 0 C dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri. Tuangkan secara bersamaan ke dalam petridish. Inkubasikan sehingga tumbuh koloni-koloni bakteri. Isolasi lebih lanjut koloni bakteri yang diinginkan
Isolasi Khamir/yeast a. Cara goresan dan taburan sama dengan isolasi bakteri, hanya media agar yang digunakan berupa PGY (potato glucose yeast) atau PDA (potato dextrose agar) b. Menggunakan mikro manipulator satu sel khamir diambil dan dimasukkan ke dalam medium, sehingga pertumbuhannya hanya berasal dari satu sel saja. Untuk mengetahuinya digunakan mikroskop yang dilengkapi dengan mikromanipulator Isolasi Jamur a. Cara pengenceran dan penaburan (dilution plate method) b. Cara isolasi dengan spora dari satu sporangium c. Cara perkecambahan dari satu spora d. Cara biakan dalam tanah air (soil water culture)
B. Sreening Seleksi untuk mendapatkan mikrobia yang potensiil untuk proses fermentasi (industri) dan memisahkannya dari mikrobia yang tidak berguna untuk proses produk a. Seleksi awal hanya menentukan mikrobia yang dapat menghasilkan suatu produk, tetapi belum memperhatikan kemampuannya untuk berproduksi secara kualitatif b. Seleksi lanjut hasil seleksi awal/primer digunakan untuk memilih mikrobia yang potensiil untuk proses industri secara kuantitatif
Pada tahap sreening dilakukan identifikasi dan determinasi biakan murni hasil isolasi yang meliputi: Morfologi individual (ukuran, bentuk, ada/tidak spora, reaksi pengecatan dll) Morfologi koloni (bentuk, ukuran, warna, tekstur koloni dll) Sifat biokimia faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan (perubahan KH, hidrolisa lemak/protein, reduksi unsur-unsur, pembentukan pigmen) Patogenitas Dll
Pengujian Kualitatif: a. Mikrobia penghasil enzim amilase mikrobia hasil isolasi ditumbuhkan pada petridish berisi pati + agar, inkubasikan gores dan masukkan ke dalam tabung reaksi, + larutan Iod apabila dalam tabung reaksi terbentuk warna biru kehitaman maka mikrobia menghasilkan enzim amilase b. Mikrobia penghasil enzim lipase mikrobia hasil isolasi ditumbuhkan dalam pertidish berisi tributirin + agar, inkubasikan koloni bakteri digores, jika sekitar goresan terbentuk warna terang berarti ada enzim lipase c. Mikrobia penghasil enzim protease mikrobia hasil isolasi ditumbuhkan dalam media yang mengandung 1% skim + agar, inkubasikan. koloni bakteri digores, jika sekitar goresan berwarna terang berarti mengandung enzim protase
Pengujian Kuantitatif: Di lakukan untuk mengukur kemampuan mikrobia yang dipilih untuk keperluan industri Dilakukan dengan: a. Menghitung jumlah sel b. menghitung konsentrasi produk yang dihasilkan Kultur hasil isolasi dan screening disimpan untuk dipelihara lebih lanjut kultur yang dipelihara harus memenuhi syarat: 1. Memiliki genetika yang stabil serta tak mudah mengalami mutasi 2. Dapat tumbuh dengan cepat 3. Dapat dipelihara dalam waktu lama 4. Segera membentuk sel vegetatif atau spora sesuai yang diinginkan 5. Memiliki kemampuan sistem protek si diri
Pengujian Kuantitatif: Dilakukan untuk mengukur kemampuan mikrobia yang dipilih untuk keperluan industri Dilakukan dengan: a. menghitung jumlah sel b. Menghitung konsentrasi produk yang dihasilkan Kultur hasil isolasi dan screening disimpan untuk dipelihara lebih lanjut kultur yang dipelihara harus memenuhi syarat: 1. Memiliki genetika yang stabil serta tak mudah mengalami mutasi 2. Dapat tumbuh dengan cepat 3. Dapat dipelihara dalam waktu lama 4. Segera membentuk sel vegetatif atau spora sesuai yang diinginkan 5. Memiliki kemampuan sistem proteksi diri
Penyimpanan /Pemeliharaan Kultur 1. Penyimpanan suhu Rendah a. Penyimpanan dalam agar miring kultur ditumbuhkan dalam agar miring simpan dalam refrigerator (5 o C) atau freezer (-20 o C) setiap 6 bulan sekali dipindahkan ke media agar miring baru b. Penyimpanan spora dalam air spora jamur disuspensikan dalam air destilasi steril simpan pada suhu 5 o C
c. Penyimpanan dengan nitrogen cair Kultur sel pada fase stasioner disuspensikan dalam larutan cryoprotective agent (Gliserol 10%) masukkan dalam wadah bertutup, bekukan dengan nitrogen cair hingga suhu 150 s/d 196 o C selama penyimpanan dapat terjadi kehilangan kemampuan hidup/viabilitas permasalahan : biaya tinggi kerusakan alat karena perlakuan suhu rendah
2. Penyimpanan pada kondisi kering a. Kultur tanah (untuk menyimpan jamur/actinomycetes) tanah basah steril diinokulasikan dengan kultur jamur inkubasi beberapa hari sehingga tumbuh jamur keringkan pada suhu kamar, simpan dalam RH rendah atau refrigerator 50 % actynomycetes yang dikeringkan, dapat bertahan selama 20 tahun b. Lyophilization (Liofilisasi/freeze drying) - merupakan proses pembekuan kultur yang diikuti dengan pengeringan pada kondisi vacum dengan proses sublimasi sempurna cairan sel - kultur sel pada fase stasioner disuspensikan dalam medium pelindung (susu, sodium glutamat, glukosa-pepton) - beberapa tetes suspensi dimasukkan ke dalam ampul dibekukan dalam ruang vacum, dilanjutkan pengeringan sehingga terjadi sublimasi sempurna, ampul sublimasi = molekul air dalam protoplasma langsung dirubah menjadi uap air tanpa melalui fase cair Hasil liofilisasi : sel mikrobia bersifat liofilik (berupa tepung yang higroskopis)
Dalam lingkungan mikrobiologi dikenal 2 tipe kultur 1. Working Culture merupakan kultur yang dipakai dalam kondisi tidak terkontaminasi dan disimpan dalam agar stab/agar slant preparasi dalam bentuk spora/kultur broth yang disimpan dalam refrigerator (dikenal juga sebagai kultur stock) harus dilakukan pengujian secara periodik terhadap µ, produksi, kontaminasi 2. Primary Culture merupakan kultur yang disimpan dalam jangka waktu lama dan digunakan untuk membandingkan atau program seleksi lanjut preparasi dilakukan dengan tanah steril atau agar broth yang dilengkapi dengan penutup minyak steril atau disimpan dengan metode liofilisasi