PERBANDINGAN KADAR FENOLAT TOTAL DAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN PADA EKSTRAK DAUN TEH (Camellia sinensis [L.] O. K.) DARI KAYU ARO DENGAN PRODUK TEH HITAMNYA YANG TELAH BEREDAR B.A. Martinus, Afdhil Arel, Adi Gusman Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia Perintis Padang ABSTRACT A research have been performed concerning about phenolic total and antioxidant activity for tea leaf from Kayu Aro and product black tea by using spectrophotometry of UV-Vis. The examination concentration of phenolic total for tea were 62,085 mg/g and to product black tea 46,718 mg/g. And antioxidant activity which performed on extract tea IC 50 43,308 µg/ml and for products black tea 64,259 µg/ml. Antioxidant activity to gallic acid is IC 50 7,473 µg/ml from DPPH method. Keywords : Phenolic and antioxidant, tea leaf, spectrophotometry of UV-Vis. PENDAHULUAN Teh merupakan salah satu jenis minuman yang disukai oleh seluruh lapisan masyarakat. Teh dibuat dari pucuk daun muda tanaman teh (Camellia sinensis [L.] O.K.). Berdasarkan proses pengolahannya, produk teh dibagi menjadi empat jenis yaitu teh hijau, teh hitam, teh putih dan teh oolong. (Rohdiana, 2003). Bila dibandingkan dengan jenis minuman lain, teh ternyata lebih banyak manfaatnya. Manfaat yang dihasilkan dari minuman teh adalah memberikan rasa segar, dapat memulihkan kesehatan badan dan terbukti tidak menimbulkan dampak negatif. Khasiat yang dimiliki oleh minuman teh berasal dari kandungan zat bioaktif yang terdapat dalam daun teh. Teh Kayu Aro merupakan teh kualitas terbaik di dunia yang mempunyai aroma dan cita rasa yang spesifik yang diproduksi oleh perkebunan teh Kayu Aro, Kecamatan Kayu Aro, Kabupaten Kerinci, Propinsi Jambi. Perkebunan teh ini tercatat sebagai perkebunan teh tertua di Indonesia dan merupakan pabrik teh terbesar di dunia yang menghasilkan produk teh jenis teh hitam (Anonim, 2012). Teh hitam adalah produk teh yang dalam pengolahannya mengalami proses fermentasi, penjemuran dan penggilingan. Dalam proses pengolahan teh hitam, sebagian besar kandungan polifenolnya teroksidasi selama proses fermentasi dan membentuk pigmen teh hitam yaitu theaflavin dan thearubigin yang gugus hidroksilnya kurang aktif (Hartoyo, 2003). Oleh karena itu daun teh dengan produk teh hitam diduga memiliki kandungan fenolat dan aktivitas antioksidan yang berbeda-beda. Untuk itu dilakukan penelitian terhadap daun teh dengan produk teh hitam yang telah dipasarkan dengan metoda Spektrofotometri UV-Visibel. METODOLOGI PENELITIAN Alat dan Bahan Alat Alat-alat yang digunakan adalah seperangkat alat Rotary evaporator, seperangkat alat spektrofotometer UV-Visible, oven, timbangan analitik, botol maserasi, tabung reaksi, gelas ukur dengan berbagai ukuran, corong, cawan penguap, krus porselen, kaca arloji, pipet mikro, pipet gondok, batang pengaduk, plat tetes, pipet tetes, gegep, spatel, Kertas saring Whatman No. 1, vial, aluminium foil, botol coklat, labu ukur dengan berbagai ukuran, beaker glass, erlenmeyer. Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah daun teh dan produknya yaitu teh hitam seduhan yang beredar dipasaran, aquadest, etanol 70 %, ISSN : 2087-5045 75
etanol 96%, metanol p.a (Merck), natrium karbonat p.a (Merck), asam galat (SIGMA), reagen Folin-Ciocalteu (Merck) dan DPPH(1,1 difenil-2-fikrilhidrazil). Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel Sampel yang diambil adalah daun teh yang masih muda di daerah Kayu Aro Kerinci dan produknya yaitu teh hitam seduhan yang telah beredar diambil di minimarket kota Padang. Untuk Produk teh hitam langsung diekstraksi dengan etanol 70 % dan untuk daun teh sebelum diekstraksi, terlebih dahulu dibersihkan, dicuci dan tiriskan lalu dikering anginkan sampai bobot konstan kemudian dipotong kecil-kecil, lalu di ekstraksi dengan etanol 96%. Pembuatan Ekstrak Sampel (Keinenan, 1996) 100 gram teh direndam dengan 300 ml etanol 96 % biarkan selama 6 jam didalam botol maserasi yang berwarna gelap sambil sekali-kali diaduk. Maserat dipisahkan dan proses diulangi sampai ekstrak terakhir negatif fenolat (tiga kali) dengan jumlah dan jenis pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 40⁰C. Sehingga didapatkan ekstrak kental masingmasingnya. Pemeriksaan Metabolit Sekunder Ekstrak Sampel (Harborne, 1987) Di timbang 2 gram ekstrak teh, lalu dibasakan dengan NH 4 OH, kemudian tambahkan kloroform : air suling (1:1) 10 ml masing-masing kocok dalam tabung reaksi biarkan sejenak hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan air untuk pemeriksaan : flavonoid, fenolik dan saponin Lapisan Kloroform untuk pemeriksaan : terpenoid, steroid dan alkaloid 1. Pemeriksaan Flavonoid Diambil 1-2 tetes lapisan air letakkan pada plat tetes ditambahkan logam Mg dan 1-2 tetes HCl pekat. Timbulnya warna orange kemerahan menunjukkan adanya senyawa flavonoid. 2. Pemeriksaan Saponin Lapisan air dikocok kuat dalam tabung reaksi hingga terbentuk busa yang tidak hilang selama 15 menit. 3. Pemeriksaan Fenolik Lapisan air 1-2 tetes ditambahkan 1-2 tetes FeCl 3 terbentuk warna biru menunjukkan adanya senyawa fenolik. 4. Pemeriksaan Terpenoid dan Steroid Lapisan kloroform 1-2 tetes dimasukkan dalam plat tetes, biarkan kering tambahkan asam asetat anhidrat dengan H 2 SO 4 2N, warna merah menunjukkan adanya senyawa terpenoid dan warna biru ungu menunjukkan adanya senyawa steroid. 5. Pemeriksaan Alkaloid Dimasukkan 2-3 tetes lapisan kloroform dalam tabung reaksi tambahkan dengan 1 tetes H 2 SO 4 2N, kocok dan biarkan memisah. Diambil lapisan asam tambahkan mayer, terbentuknya kabut putih menunjukkan adanya alkaloid. Penentuan Susut Pengeringan (Depkes, 1979) Masing-masing ekstrak kental sampel yang telah diperoleh kemudian ditentukan susut pengeringannya sebagai berikut : Tata krus porselen beserta tutupnya selama 30 menit didalam oven pada suhu 105⁰C, dinginkan kemudian timbang krus lalu masukkan masing-masing ekstrak sampel kedalam masing-masing krus seberat 1 gram goyang krus perlahan agar ekstrak merata, kemudian masukkan kedalam oven. Krus berisi ekstrak dipanaskan pada suhu 105⁰C selama 1 jam. Setelah itu keluarkan dari dalam oven, dan dinginkan dalam desikator lalu timbang. Lakukan hal seperti diatas sampai diperoleh berat yang konstan dimana selisih antara dua kali penimbangan berturut-turut tidak lebih dari 0,5 gram dan dilakukan pada masing-masing ekstrak. % susut pengeringan = [ (B-A) (C-A) ] x 100% (B A) A = Berat krus setelah dioven B =Berat krus berisi ekstrak sebelum dioven C = Berat krus berisi ekstrak setela dioven Pembuatan Reagen (Waterhause, 1999) A. Pembuatan Larutan Natrium Karbonat 1 M Ditimbang 5,3 g natrium karbonat kemudian masukkan dalam labu ukur 50 ml, ISSN : 2087-5045 76
tambahkan aquadest sampai tanda batas, kocok hingga homogen. B. Pembuatan Larutan Induk Asam Galat(5mg/ml) Timbang 0,125 gram asam Galat, dimasukkan dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan 2,5 ml etanol 96 %, kemudian ditambahkan aquadest sampai tanda batas. C. Pembuatan Larutan DPPH 35 µg/ml Ditimbang sebanyak 10 mg DPPH dan dilarutkan dengan Metanol didalam labu ukur 100 ml sampai tanda batas, Lalu pipet 17,5 ml, masukkan dalam labu ukur 50 ml lalu tambahkan metanol sampai tanda batas. Penentuan Kadar Fenolat Total dengan Metoda Folin-Ciocalteu A. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum Asam Galat dengan Reagen Folin-Ciocalteu (Pourmorad et al., 2006) Buat larutan standar asam galat dengan konsentrasi 40 µg/ml dengan cara memipet 0,2 ml larutan induk asam galat (5 mg/ml) lalu diencerkan dengan campuran metanol : aquadest (1:1) dalam labu ukur 25 ml sampai tanda batas. Larutan standar 40 µg/ml dipipet 0,5 ml masukkan dalam vial lalu tambahkan 5 ml pereaksi Folin-Ciocalteu yang sudah diencerkan 1:10 dengan aquadest tambahkan 4 ml larutan natrium karbonat 1 M kocok homogen. Ukur serapan pada panjang gelombang 400-800 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. B. Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat (Mosquera et al., 2007) Dari larutan induk Asam Galat dipipet 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml dan diencerkan dengan campuran metanol : aquadest (1:1) dalam labu ukur 25 ml sampai tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 µg/ml asam galat. Dari masing-masing larutan dipipet 0,5 ml kemudian dicampurkan dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu (diencerkan 1:10) dengan aquadest tambahkan 4 ml larutan natrium karbonat 1 M biarkan selama 15 menit, ukur serapan pada panjang gelombang 760 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. C. Penentuan Kadar Senyawa Fenolat Total Ekstrak Sampel dengan Metoda Folin- Ciocalteu (Pourmorad et al., 2006) Timbang 50 mg masing-masing ekstrak kemudian larutkan dalam labu ukur 50 ml dengan metanol sampai tanda batas, lalu encerkan lagi dalam labu ukur 10 ml dengan cara memipet 1 ml sehingga didapatkan konsentrasi 100 ppm. Pipet 0,5 ml masukkan kedalam tabung reaksi, kemudian tambahkan 5 ml reagen Follin-Ciocalteu yang sudah diencerkan 1: 10 dengan aquadest ditambahkan kedalam vial dan di kocok. Setelah 5 menit, ke dalam vial tersebut ditambahkan 4 ml natrium karbonat dan di kocok homogen, biarkan selama 15 menit, kemudian diukur nilai serapannya pada panjang gelombang 760 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Metoda DPPH A. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH (Mosquera et al., 2007) Pipet sebanyak 4 ml larutan DPPH 35 µg/ml yang baru dibuat, dimasukkan kedalam vial gelap, ditambahkan 2 ml campuran aquadest-metanol (1:1), tutup vial dan biarkan selama 30 menit ditempat yang gelap. Serapan larutan diukur dengan spektrofotometer UV- Visible pada panjang gelombang 400-800 nm. B. Penentuan IC 50 Asam Galat (Pourmorad et al., 2006) Dibuat larutan pembanding asam galat dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8 dan 10 µg/ml dengan cara memipet 1 ml larutan induk asam galat (5mg/mL) yang kemudian dilarutkan dengan campuran metanol dan air suling (1:1) dalam labu ukur 100 ml sampai tanda batas, sehingga didapat larutan asam galat dengan konsentrasi 50 µg/ml. Dari larutan ini masingmasing dipipet 2; 4; 6; 8; 10 ml, masukkan dalam labu ukur 50 ml, tambahkan campuran metanol dan air suling (1:1) hingga tanda batas. Pipet sebanyak 2 ml masing-masingnya lalu dimasukkan kedalam vial, tambahkan 4 ml larutan DPPH 35 µg/ml. Diamkan selama 30 menit ditempat gelap. Serapan larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Visibel pada panjang gelombang 518,5 nm. Hitung % inhibisi masing-masingnya lalu buat kurva antara konsentrasi larutan pembanding Asam Galat dengan % inhibisi sehingga diperoleh persamaan regresi linearnya. IC50 Asam Galat adalah konsentrasi larutan pembanding Asam Galat yang memberikan inhibisi sebesar 50% yang dapat dihitung ISSN : 2087-5045 77
menggunakan persamaan regresi linear yang telah diperoleh. C. Penentuan IC 50 Larutan Ekstrak Sampel (Mosquera et al., 2007) Ditimbang masing-masing ekstrak sebanyak 50 mg, kemudian dilarutkan dengan metanol dalam labu ukur 50 ml sampai tanda batas, sehingga didapatkan konsentrasi 1mg/mL. Dari larutan ekstrak dipipet 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 ml. Kemudian tambahkan metanol : aquades (1:1) dalam labu ukur 25 ml sampai tanda batas. Sehingga diperoleh larutan ekstrak dengan konsentrasi 20; 40; 60; 80; dan 100 µg/ml. Pipet masing-masing konsentrasi sebanyak 2 ml larutan sampel dengan pipet mikro lalu masukkan ke dalam vial, ditambahkan 4 ml larutan DPPH 35 µg/ml. Diamkan selama 30 menit ditempat gelap. Serapan larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 518,5 nm. Pengolahan Data Kadar fenolat total dalam sampel dihitung dengan menggunakan rumus persamaan regresi linear yang diperoleh dari kurva kalibrasi. y = a + bx y = absorban Sampel a = Konstanta b = Koefisien regresi x = Konsentrasi sampel Konsentrasi sampel : Ksf = Ksf = Konsentrasi sampel fenolat (µg/ml) C = Konsentrasi fenolat terukur (µg/ml) Fp = Faktor pengenceran sampel W = Berat total ekstrak kental (g) W = Berat total sampel kering (g) Kadar fenolat total yang diperoleh dilanjutkan dengan uji t berpasangan dengan program SPPS 17.00. Penentuan aktivitas antioksidan ekstrak teh. Aktivitas antioksidan ditentukan oleh besarnya hambatan serapan radikal DPPH melalui perhitungan persentase inhibisi serapan DPPH. A. % Inhibisi % inhibisi = Absorban kontrol = serapan larutan radikal DPPH 35 µg/ml pada panjang gelombang serapan maksimum Absorban sampel = serapan larutan sampel ditambah larutan radikal DPPH 35 µg/ml dikurangi serapan larutan sampel tanpa DPPH pada pada panjang gelombang serapan maksimum B. Nilai IC 50 Nilai IC 50 dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil yang diperoleh dari penelitian yang telah dilakukan sebagai berikut : 1. Dari 100 gram teh, didapatkan ekstrak kental masing-masingnya : - Daun teh = 17,3 gram - produk teh hitam = 20 gram 2. Hasil penentuan persentase susut pengeringan masing-masing ekstrak : - Daun teh = 21,1 % - produk teh hitam = 10,589 % 3. Hasil penetapan kadar senyawa fenolat total yang didapat pada masing-masing ekstrak teh. - Daun teh = 62,085 mg/g (6,2 % b/b) - Produk teh hitam = 46,718 mg/g (4,7 % b/b) 4. Hasil perhitungan IC50 larutan Asam Galat sebagai pembanding pada penentuan aktivitas antioksidan sebesar 7,473 µg/ml. 5. Hasil perhitungan IC 50 dari masing-masing ekstrak. - daun teh = 43,308 µg/ml - produk teh hitam = 64,259 µg/ml 6. Kesetaraan aktivitas antioksidan masingmasing ekstrak dengan pembanding Asam Galat. ISSN : 2087-5045 78
- 1 mg Asam Galat setara dengan 5,795 mg ekstrak daun teh - 1 mg Asam Galat setara dengan 8,599 mg ekstrak produk teh hitam Sampel daun teh yang telah diambil lalu dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang melekat pada sampel lalu dikering anginkan, lalu dirajang untuk memperluas permukaan kontak antara pelarut dengan sampel sedangkan untuk Produk teh hitam langsung diekstraksi. Metode ekstraksi yang digunakan adalah cara maserasi karena merupakan metoda yang sederhana dan mudah dilakukan dengan merendam sampel dalam etanol yang dapat melarutkan zat polar sampai non polar. Untuk sampel daun teh diekstraksi menggunakan etanol 96 % karena sampel ini telah cukup mengandung air sedangkan untuk sampel produk teh hitam diekstraksi menggunakan etanol 70 % karena sampel dalam bentuk kering sehingga kandungan airnya relatif sedikit tujuannya untuk mempermudah membuka poripori sampel tersebut (Keinenan, 1996). Semua filtrat yang diperoleh dari hasil ekstraksi diuapkan menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental untuk daun teh sebanyak 17,3 gram dan produk teh sebanyak 20 gram. Pemeriksaan metabolit daun teh mengandung senyawa fenolik, alkaloid, flavonoid, dan terpenoid sedangkan produk teh hitam hanya mengandung Alkaloid, flavonoid dan fenolik. Hasil persentase susut pengeringan didapatkan nilai persentase susut pengeringan untuk ekstrak daun teh lebih besar yaitu 21,1% dibandingkan ekstrak produk teh hitam yaitu 10,589%. Untuk penetapan kadar senyawa fenolat digunakan pereaksi Folin-Ciocalteu karena reagen ini sensitif terhadap senyawa fenol dan menggunakan reagen dalam jumlah sedikit serta dapat bereaksi dalam waktu yang singkat. Reagen Folin-Ciocalteu berwarna kuning dan akan membentuk komplek berwarna biru tua saat ditambahkan Natrium Carbonat sehingga dapat ditentukan absorbannya dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 760 nm (Waterhause, 1999). Asam Galat digunakan sebagai larutan standar karena asam galat merupakan salah satu jenis golongan senyawa fenolat dan merupakan senyawa yang murah, murni dan mempunyai kestabilan yang tinggi. Dari pemeriksaan larutan standar asam galat didapat kurva kalibrasi dengan persamaan regresi Y = 0,0355 + 0,008355x dan harga koefisien korelasi (r) yaitu 0,998; simpangan baku (SB) =0,022 ; batas deteksi (BD) = 7,899 µg/ml; dan batas kuantisasi =26,332 µg/ml. Nilai r yang mendekati 1 membuktikan bahwa persamaan regresi tersebut adalah linier dan simpangan baku yang kecil menunjukkan ketepatan yang cukup tinggi. Hasil penetapan kadar senyawa fenolat total menggunakan persamaan regresi linier asam galat didapatkan kadar fenolat total dalam masing-masing ekstrak daun teh adalah sebagai berikut : Ekstrak Daun teh 62,085 mg/gr dan ekstrak produk teh hitam 46,718 mg/gr. Berdasarkan analisa statistika dengan uji t berpasangan menggunakan program SPSS 17.00 menunjukkan perbedaan yang signifikan antara daun teh dengan produk teh hitam dengan nilai signifikan p < 0,05 sehingga dapat disimpulkan bahwa kedua larutan ekstrak teh tersebut ada perbedaan yang bermakna. Jumlah kadar fenolat yang berbeda-beda ini membuktikan kandungan fenolat dalam teh hitam lebih rendah dibandingkan dengan daun teh. Perbedaan kandungan ini dikarenakan pada teh hitam polifenolnya sebagian besar teroksidasi selama proses fermentasi, sehingga polifenol dalam teh hitam berkurang kandungannya (Hartoyo, 2003). Untuk pengujian aktivitas antioksidan sampel dipakai metoda DPPH, karena merupakan metoda yang sederhana, mudah, peka dan hanya memerlukan sedikit sampel dengan waktu yang relatif singkat. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan cepat teroksidasi karena udara dan cahaya. Senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan akan bereaksi dengan DPPH yang ditunjukkan dengan perubahan warna dari ungu violet menjadi kuning karena terjadi donor atom hidrogen dari antioksidan ke DPPH lalu diukur absorbannya dengan spektrofotometer Uv-Vis (Waterhause, 1999). Besarnya aktivitas antioksidan ditandai dengan nilai IC 50, yaitu larutan sampel yang dibutuhkan untuk menghambat 50 % radikal bebas DPPH. Masing - masing ekstrak teh ditentukan aktivitas antioksidannya. Kekuatan ISSN : 2087-5045 79
aktivitas antioksidan ekstrak teh dibandingkan terhadap zat pembanding yang telah diakui sebagai antioksidan yaitu asam galat. Aktivitas antioksidan dari asam galat ditunjukkan dari nilai IC 50 nya yaitu 7,473 µg/ml. Aktivitas antioksidan sampel untuk ekstrak daun teh yaitu 43,308 µg/ml yang lebih besar dibandingkan produk teh hitam yaitu 64,333 µg/ml. Nilai IC 50 yang semakin rendah menunjukkan aktivitas antioksidan yang semakin tinggi. Dari uraian diatas terlihat bahwa ekstrak daun teh mempunyai nilai IC 50 yang lebih rendah dibandingkan produk teh hitam, hal ini berarti aktivitas antioksidan daun teh lebih kuat dibandingkan dengan produk teh hitam, tetapi apabila dibandingkan dengan aktivitas antioksidan pembanding asam galat yang memiliki nilai IC 50 sebesar 7,473 µg/ml, aktivitas antioksidan ekstrak daun teh masih lebih rendah. Hal ini karena pada penelitian ini yang di uji masih berupa hasil ekstraksi belum merupakan senyawa murni. (Betula Pendula Roth) Leaf Phenolics, 44: 2724-2727, Finlandia. Mosquera, O M., Y. M. Correa, D. C. Buitrago, and J. Nino, 2007, Antioxidant Activity of Twenty five Plants from Colombian biodiversity, Mem. Inst. Oswaldo Crus, vol. 102 (5) ; 631-634. Pourmorad, F, Hosseinimehr, SJ and Shahabimajd, N. 2006, Antioxidant Activity, Phenol and Flavonoid Content of Some Selected Iranian Medicinal Plants, Africa Journal of Biotechnology, Vol (11), 1142-1145. Rohdiana, Dadan. 2003, Teh ini Menyehatkan. Penerbit Alfabeta, Bandung. Waterhause, A. 1999, Folin-ciocalteu Micro Method for Total Phenol in Wine, American Journal of Enology and Viticulture, 28 ; 1-3. KESIMPULAN Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan terdapat perbedaan kadar fenolat dan aktivitas antioksidan dari daun teh dengan produk teh hitam yang beredar dipasaran dengan nilai P < 0,05 DAFTAR PUSTAKA Anonim,2012.http://mursyidyusmar.wordpress.c om/tag/teh-kajoearo/.access on (Agustus 2012). Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, Ditjen POM, Jakarta. Harborne, J. B 1987, Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Edisi Kedua, Penerjemah : K. Padmawinata & I. Soediro. Penerbit ITB, Bandung. Hartoyo, A. 2003, Teh dan Khasiatnya bagi Kesehatan. Penerbit Kanisius, Yogyakarta. Keinenan, M, and J-T, Riitta, 1996. Effect of Sample Preparation Method on Birch ISSN : 2087-5045 80