BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian diawali dengan pengambilan sampel susu pasteurisasi impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta. Pengujian dilakukan di Balai Uji Terap Teknik dan Metode Karantina Pertanian (BUTTMKP), Balai Pengujian Mutu Produk Peternakan (BPMPP), dan Balai Besar Penelitian Veteriner (BBalitvet). Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan April 2012. Alat dan Bahan Pengujian Pendahuluan Bahan yang digunakan adalah susu pasteurisasi impor, H 2 O 2 0.5%, HCl paraphenilin diamine 2%, amonium sulfat jenuh (NH 4 ) 2 SO 4. Peralatan yang diperlukan adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi, timbangan, tabung erlenmeyer. Pengujian Bioassay Bahan yang digunakan adalah susu pasteurisasi impor, mikroorganisme (Spora Bacillus stearothermophilus ATCC 7953), peptone (Difco 211677), yeast extract (Difco 212750), bacto agar (Difco 214010), dextrose (Difco 215530), natrium penisilin (Sigma P-7794), K 2 HPO 4 (Merck 1.047831.000), Na 2 HPO 4 (Merck 1.065860.500), aquadest, kertas cakram steril (diameter 8 mm). Peralatan yang diperlukan adalah cawan petri, tabung reaksi, tabung sentrifus, labu ukur, gelas ukur, erlenmeyer, pipet volumetrik, pengocok tabung, magnet pengaduk, ph meter, mikro pipet, jangka sorong, ose, dan pinset. Pengujian HPLC Bahan yang digunakan adalah susu pasteurisasi impor, aquades, asetonitril, metanol, bufer fosfat (ph = 8.5), 0.05 mol/l: 8.7 g kalium fosfat dilarutkan dalam 1000 ml aquades, larutan antibiotika standar (penisilin 1 mg/ml) dalam metanol, H 2 SO 4 0.17 M, Sodium Tungstad 5%, NaCl, bufer fosfat 0.2 M. Peralatan yang digunakan adalah sentrifus dingin, evaporator, HPLC
16 colum agilent ZORBAX Eclips Plus, 2.1 mm x 100 mm, 3.5 μm (p/n 59793-902), dan HPLC dengan diode array detector (Agilent Technologies, Inc, USA). Rancangan Penelitian Sampel yang diuji adalah susu pasteurisasi impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta. Jumlah sampel yang diambil, dihitung dengan menggunakan rumus deteksi penyakit (detect disease) (Martin et al. 1987). n = [1- (1-a) 1/D ] [N-(D-1)/2] Keterangan : N = Jumlah populasi n = Ukuran sampel a = Tingkat kepercayaan (95%) D = Nilai dugaan populasi yang sakit (D=PxN, dengan asumsi P:5%) Seluruh sampel diuji dengan menggunakan metode bioassay secara triplo. Sampel yang menunjukkan hasil positif pada bioassay, dikonfirmasi dengan metode HPLC. Metode Penelitian Pengumpulan Sampel Pengambilan sampel untuk penelitian ini dilakukan dengan cara mengambil susu pasteurisasi secara acak sederhana. Susu pasteurisasi impor setiap kedatangan diambil sebanyak 12 sampel, hingga jumlah sampel terpenuhi. Sebelum diuji, sampel disimpan dalam lemari pendingin suhu -20 C. Uji Pendahuluan Uji Storch merupakan uji kesempurnaan proses pasteurisasi. Reaksi positif menunjukkan susu yang sudah mengalami pemanasan. Reaksi ini terjadi setelah kedalam 5 ml sampel susu ditambahan 4 tetes H 2 O 2 0.5% dan 2 tetes HCl paraphenilin diamine 2%. Reaksi positif memperlihatkan warna putih (susu pasteurisasi), sedangkan reaksi negatif memperlihatkan warna biru (susu mentah atau mengandung 5% susu mentah).
17 Uji Aschaffenburg atau uji kekeruhan dilakukan untuk mengetahui apakah susu telah mengalami proses pemanasan yang melebihi suhu pasteurisasi. Pada 20 ml sampel susu pasteurisasi ditambahkan 4 g amonium sulfat jenuh (NH 4 ) 2 SO 4 dan dikocok. Kemudian campuran tersebut disaring ke dalam tabung reaksi dan filtratnya dimasukkan dalam penangas air (mendidih) selama 5 menit. Filtrat yang jernih menyatakan tidak ada albumin dalam susu dan susu tersebut telah dipanaskan diatas titik didih susu (>100.16 C). Uji Bioasay Uji tapis untuk mendeteksi residu beta laktam dalam susu dilakukan dengan menggunakan metode bioassay. Uji ini untuk mendeteksi adanya residu antibiotika dengan cepat, mudah digunakan, dan relatif tidak mahal. Secara umum, tahapan pengujiannya terdiri dari persiapan, pengujian, dan pembacaan hasil. Persiapan, meliputi persiapan media agar, kultur media, larutan dapar, dan larutan baku. Persiapan media agar, sebanyak 5 g peptone, 12 g yeast extract, 15-18 g bacto agar, 1 g dextrose, dilarutkan dalam 1000 ml aquadest, kemudian diukur pada ph 5.7±0.1 dan dididihkan. Media disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 C dengan tekanan 15 psi (pound per square inchi) selama 15 menit. Persiapan kultur media. Bakteri Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 55 C selama 1 minggu. Bakteri yang telah ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam tabung berisi larutan NaCl fisiologis steril 20 ml. Larutan kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65 C selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan supernatan (lapisan atas) dibuang. Kemudian ditambahkan NaCl fisiologis steril secukupnya lalu dikocok. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam refrigerator dengan suhu 4 C selama 18-24 jam. Larutan tersebut dipanaskan kembali dalam penangas air pada suhu 65 C selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 1 000 rpm selama 5 menit dan diambil supernatannya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai suspensi spora.
18 Pembuatan larutan dapar fosfat. Sebanyak 7 g K 2 HPO 4, 6 g Na 2 HPO 4, dilarutkan dalam 1000 ml aquadest, kemudian larutan disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Larutan baku untuk kontrol antibiotika. Standar penicillin ditimbang kemudian diencerkan dengan larutan dapar dari konsentrasi 1 000 IU/mL hingga 0.01 IU/mL. Larutan dengan konsentrasi 0.01 IU/mL digunakan sebagai larutan standar kerja. Pengujian dengan bioassay. Sebanyak 10 ml sampel dimasukkan dalam tabung reaksi. Sementara itu, kultur media disiapkan dengan menuangkan 8 ml pada setiap cawan petri. Selanjutnya kertas cakram steril diletakkan di atas permukaan kultur media. Tiap cawan petri berisi 5 buah kertas cakram, yang terdiri dari 3 buah cakram yang masing-masing ditetesi 75 μl sampel yang akan dianalisa, satu kertas ditetesi 75 μl larutan baku antibiotika 0.01 IU/mL sebagai kontrol positif, dan satu kertas lagi ditetesi larutan dapar fosfat sebagai kontrol negatif. Cawan petri ditutup dan diinkubasi pada suhu 55 C selama 16-18 jam. Pengujian sampel dilakukan dengan tiga kali pengulangan untuk mendapatkan data yang akurat. Pembacaan hasil dilakukan dengan mengamati dan mengukur diameter zona hambatan yang terbentuk disekeliling kertas cakram menggunakan jangka sorong. Sampel dinyatakan positif mengandung antibiotika apabila zona hambat yang terbentuk 2 mm dari tepi kertas cakram. Sampel dinyatakan negatif apabila zona hambat yang terbentuk 0 2 mm. Karena zona hambat yang terbentuk < 2 mm dianggap akibat adanya natural inhibitor. Diameter zona hambatan pada kontrol positif sebesar 20 ± 1 mm, sedangkan kontrol negatif tidak membentuk zona hambat (SNI 2008). Uji Konfirmasi (HPLC) Uji konfirmasi untuk mendeteksi residu beta laktam dalam susu pasteurisasi dilakukan dengan menggunakan HPLC. Metode ini didasarkan pada reservedphase chromatography dan multisignal UV-visiblediode-aray detection (UV- DAD). Spektrum UV berperan sebagai alat identifikasi tambahan (Husgen dan Schuster 2001). Alat HPLC diatur pada kolom 15 cm x 3.9 mm, kecepatan aliran
19 0.8 ml/menit, fase gerak (A: aquades/10 mm amonium asetat dan B: asetonitril), run time 12 menit, jeda 3 menit, suhu 180 C, injeksi 50 μl. Tahap persiapan: 5 ml susu dimasukkan dalam tabung sentrifus yang mempunyai tutup, ditambahkan 25 ml aquadest dan 4 ml H 2 SO 4 0.17 M serta 4 ml Sodium Tungstad 5%, dihomogenkan selama 2 menit kemudian disentrifus dengan kecepatan 3.000 rpm selama 10 menit. Larutan supernatant dipisahkan dari residunya kemudian ditambahkan 10 ml NaCl 20% pada filtratnya. Tahap pemurnian, yaitu ke dalam kartrid C18 dialirkan perlahan-lahan 10 ml metanol, 10 ml aquades, 10 ml NaCl 2%. Kemudian dialirkan sampel. Bilas kartrid C18 dengan mengalirkan 10 ml NaCl 2% dan 10 ml aquades. Selanjutnya sampel di-elusi dengan 3 ml bufer fosfat 0.2 M dalam asetonitril (pelarut elusi penisilin). Hasil elutan kemudian dipindahkan ke dalam aliran gas nitrogen sampai kering. Residu disuspensikan kembali dengan 10 ml fase gerak (asetonitril 0.1%), kemudian divortex selama 2 menit dan dipindahkan ke dalam vial 2 ml untuk dimasukkan dalam alat HPLC. Hasil dari pengujian dengan HPLC ditampilkan dalam bentuk kromatogram. Waktu dan volume retensi pada setiap senyawa ditunjukkan dengan munculnya beberapa puncak. Uji kualitatif dilakukan dengan mencocokkan waktu retensi masing-masing puncak pada kromatogram sampel dengan waktu retensi senyawa standar. Lebar dan tinggi puncak digunakan untuk menentukan besarnya konsentrasi diukur secara otomatis oleh alat pengolah data. Analissis Data Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisis deskriptif dengan menyajikan data dalam bentuk tabel dan gambar.