II. METODE PENELITIAN A. Materi dan Deskripsi Lokasi 1. Bahan Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah daun 10 kultivar kacang tanah ( kultivar Bima, Hypoma1, Hypoma2, Kancil, Kelinci, Talam, Tuban, Domba, Jerapah, dan Bison). Kemikalia yang diperlukan xylol, alkohol 96%, ethanol, asam asetat glasial, parafin, formalin, gliserin, albumin, safranin 1% dalam alkohol 70%, akuades, entellan, dan kutek bening (Lampiran 1). 2. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroskop binokuler, kamera digital, gelas ukur, gelas Beaker, gelas Erlenmeyer, oven, pipet, pinset, silet, botol vial, rotary microtom, penggaris, holder, baki, mikrometer obyektif, mikrometer okuler, kertas karton, square micrometer, gelas benda, gelas penutup, hot plate dan kertas label (Lampiran 1). 3. Deskripsi Lokasi Daun kacang tanah diambil di persawahan Sumampir, Kecamatan Purwokerto Utara, Kabupaten Banyumas. Pengamatan dilakukan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian ini dilaksanakan selama 4 bulan, dimulai pada bulan November 2013-Februari 2014. B. Bagan Alir Penelitian Penanaman bibit kacang tanah Pemeliharaan tanaman kacang tanah Pengambilan sampel daun kacang tanah umur 2 bulan Pembuatan preparat segar daun Pembuatan preparat awetan daun Menghitung jumlah stomata dan trikomata serta ukuran stomata (panjang dan lebar) Mengukur tebal daun dan tebal mesofil Hasil berupa data karakter anatomi yang diamati 1. Langkah Pembuatan Preparat Awetan Menggunakan Metode Parafin 5
Sampel daun kacang tanah dipotong 1x1 cm Fiksasi Larutan Fiksatif FAA dalam alkohol 70% @ 24 jam Dehidrasi Alkohol bertingkat 70%, 80%, 96% dan ethanol @ Dealkoholisasi Alkohol/xylol 3:1, 1:1, 1:3 @ Infiltrasi Xylol/paraffin 1:9 @ 24 jam, paraffin murni @ 2 jam suhu 57 o C Penyelubungan Dicetak dalam kotak dari kertas karton Pengirisan Ditempel pada holder, diiris menggunakan rotary microtom dengan tebal irisan 10 µm Perekatan Pita paraffin diletakkan diatas gelas benda yang telah diolesi gliserin/albumin 1:1 dan diolesi air Pewarnaan Gelas benda berisi potongan organ dimasukkan ke: Xylol 2, xylol 1 @ Alkohol/xylol 1:3, 1:1, 3:1 @ Ethanol, alkohol 96%, 80%, 70% @ Safranin 1% dalam alkohol 70% @ 2 jam Alkohol 70%, 80%, 90%, ethanol @ Alkohol/xylol 3:1, 1:1, 1:3 @ Xylol 1, xylol 2 @ Penutupan Ditetesi entellan dan ditutup gelas penutup, dikeringkan diatas hot plate Pemberian nama dengan kertas label Hasil berupa data karakter anatomi tebal daun dan tebal mesofil 6
2. Langkah Pembuatan Preparat Segar Daun Sampel daun kacang tanah Diolesi kutek bening hingga kering Lapisan kutek dilepas kemudian diletakkan di atas gelas benda dan ditutup dengan gelas penutup Dihitung jumlah stomata per mm 2 dan ukuran stomata (panjang dan lebar) Dihitung jumlah trikomata per mm 2 Hasil berupa data karakter anatomi yang diamati C. Metode Penelitian 1. Metode penelitian Metode yang digunakan adalah metode survei dengan teknik pengambilan sampel terpilih (purposive sampling). 2. Variabel Penelitian Variabel yang digunakan penelitian ini ada 2 macam yaitu variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas adalah kultivar kacang tanah yang digunakan sedangkan variabel tegantung adalah karakter anatomi daun kacang tanah yang diamati. 3. Parameter Penelitian Parameter yang diamati meliputi tebal daun, tebal mesofil daun, jumlah stomata dan trikomata per mm 2, serta ukuran stomata (panjang dan lebar). 4. Cara Kerja Penelitian 4.1. Prosedur Umum Bibit tanaman kacang tanah dipilih kemudian ditanam di lahan persawahan. Pemeliharaan tanaman dilakukan sesuai prosedur standar Dinas Pertanian. 7
4.2. Pembuatan Preparat Anatomi Daun Pembuatan preparat awetan daun dengan metode parafin adalah sebagai berikut: a. Daun dipotong ± 1 cm menggunakan pisau silet yang tajam. b. Potongan daun tersebut difiksasi menggunakan larutan fiksatif FAA selama 24 jam. Larutan FAA terdiri dari : Alkohol... 90 ml Asam asetat glasial... 5 ml Formalin... 5 ml c. Dehidrasi : Fiksatif diganti berturut turut dengan : Alkohol 70%... Alkohol 80%... Alkohol 96%... Alkohol 100%... d. Dealkoholisasi : Alkohol diganti berturut turut dengan : Campuran alkohol/xylol 3 : 1... Campuran alkohol/xylol 1 : 1... Campuran alkohol/xylol 1 : 3... Xylol I... Xylol II... e. Infiltrasi : potongan daun dimasukkan ke dalam campuran xylol/parafin 1 : 9 dengan temperatur 57 o C selama ± 24 jam. Campuran xylol/parafin diganti dengan parafin murni pada temperatur 57 o C selama 2 jam. f. Penyelubungan : dibuat kotak kotak kecil dari kertas karton kemudian parafin cair dituang ke dalam kotak kotak yang telah diolesi dengan gliserin. Potongan daun dimasukkan ke dalam kotak sehingga tepat di tengah selubung parafin dan dibiarkan membeku. g. Pengirisan : blok berisi jaringan dipotong sedemikian rupa, ditempel pada holder mikrotom. Pemotongan jaringan menggunakan mikrotom dengan tebal 10 µm. h. Perekatan : irisan dilekatkan pada gelas benda dengan campuran gliserin/albumin 1:1 yang telah dibubuhi air. Kemudian gelas benda diletakkan di atas pemanas (hot plate). i. Pewarnaan : gelas benda berturut turut dimasukkan ke dalam : Xylol II... 8
Xylol I... Campuran alkohol/xylol 1 : 3... Campuran alkohol/xylol 1 : 1... Campuran alkohol/xylol 3 : 1... Alkohol 100%... Alkohol 96%... Alkohol 80%... Alkohol 70%... Safranin... 2 jam Alkohol 70%... Alkohol 80%... Alkohol 96%... Alkohol 100%... Campuran alkohol/xylol 3 : 1... Campuran alkohol/xylol 1 : 1... Campuran alkohol/xylol 1 : 3... Xylol I... Xylol II... j. Penutupan : irisan diberi entellan dan ditutup dengan gelas penutup. Kemudian dikeringkan di atas pemanas (hot plate) hingga entellan cukup kering. k. Pemberian nama : di sebelah kiri gelas penutup dilekatkan label/etiket dengan diberi keterangan nama, spesies, organ, dan arah irisan. 4.3. Menghitung Jumlah Stomata dan Trikomata per mm 2 Penghitungan jumlah stomata dan trikomata sebagai berikut: a. Permukaan daun bagian bawah (abaksial) diberi kutek bening dan didiamkan hingga kutek mengering. Kutek kemudian diangkat secara hati - hati agar stomata menempel pada lapisan kutek tersebut. Permukaan daun yang terdapat stomata diletakkan di atas gelas benda, ditetesi air kemudian ditutup gelas penutup. b. Stomata dan trikomata diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400X. c. Jumlah stomata dan trikomata yang terlihat dalam bidang hitung, sehingga didapat jumlah stomata dan trikomata per luas bidang pdanang tersebut. 9
d. Diameter bidang pdanang pada perbesaran 400X diukur menggunakan mikrometer untuk menghitung luas bidang pandang tersebut. e. Luas bidang pandang dihitung dengan rumus : A = π r 2 (2-1) Keterangan : A = Luas bidang pandang π = tetapan (3.14) r = diameter bidang pandang : 2 f. Kerapatan stomata dan trikomata = jumlah stomata dan trikomata per luas bidang pandang. 4.4. Mencari Nilai Skala Mikrometer Okuler Mencari nilai skala okuler yaitu: a. Mikrometer okuler diletakkan pada lensa okuler mikroskop, dilihat hingga bayangan skala mikrometer okuler jelas. b. Mikrometer objektif diletakkan di atas meja objek, dicari bayangan yang jelas dari skala mikrometer objektif tersebut bersama sama dengan bayangan skala mikrometer okuler. c. Kedua bayangan skala tersebut dibuat sejajar dengan memutar tabung okuler. Titik 0 dari kedua skala tersebut diletakkan sama tinggi dengan menggunakan mikrometer objektif. d. Bayangan garis skala kedua mikrometer dicari yang berhimpit. Jumlah bagian skala pada masing masing mikrometer dihitung dari titik 0 sampai garis skala yang berhimpit tadi. e. Jarak sesungguhnya antara kedua garis skala mikrometer objektif diketahui sehingga nilai skala mikrometer okuler dapat dihitung dengan rumus : X Sob = Y Sok Sob = Y Sok X Sok = Sob (2-2) Keterangan : Sob = Skala mikrometer objektif Sok = Skala mikrometer okuler 10
4.5. Mengukur Tebal Daun, Mesofil Daun, dan Ukuran (Panjang dan Lebar ) Stomata Mengukur tebal daun, mesofil daun, dan ukuran stomata dilakukan dengan tahapan berikut: a. Mikrometer objektif diambil, diganti dengan preparat. b. Bayangan preparat dicari. Kombinasi objektif, okuler serta panjang tubus sama dengan waktu mencari nilai skala okuler. c. Bayangan skala mikrometer okuler ditempatkan pada bayangan preparat sedemikian rupa hingga arah bayangan skala itu sesuai dengan arah panjang atau lebar sel. Nilai panjang dan lebar stomata jumlah bagian skala dikalikan dengan nilai skala mikrometer okuler. D. Metode Analisis Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif untuk mengetahui perbedaan karakter anatomi daun dari 10 kultivar kacang tanah yang diamati. 11