18 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN Penelitian ini dilakukan selama ± 2 bulan (Mei - Juni) bertempat di Laboratorium Kimia, Jurusan Pendidikan Kimia dan Laboratorium Mikrobiologi di Universitas Negeri Gorontalo. 3.2 ALAT DAN BAHAN 3.2.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat destilasi, seperangkat alat titrasi, seperangkat alat refluks, neraca analitik, labu takar, gelas ukur, gelas kimia, alkoholmeter, oven, labu erlenmeyer, pipet tetes, pipet mikro spatula, kertas saring, corong, ayakan, inkubator, batang pengaduk, cawan petri, penangas, tabung reaksi, rak tabung reaksi, botol reagen, termometer, ph meter, shaker inkubator, vortex, autoclave, pembakar bunsen, jarum ose, colony counter, IR (Infra Merah). 3.2.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit pisang raja, H 2 SO 4 0,1, 0,3, 0,5M dan 25%, Reagen Luff Schoorl, KI 30%, Aquadest, Saccharomyces cerevisiae, Ammonium sulfat, Urea, NaOH 25%, PDA ( Potato Dextrose Agar), PDB (Potato Dextrose Borth). 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Preparasi Sampel Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah limbah kulit pisang raja yang didapatkan dari daerah Kota Kotamobagu yang telah di cuci dan di potong-
19 potong kemudian dikeringkan dibawa sinar matahari selama 5 jam selanjutnya kulit pisang yang telah kering di giling menggunakan gilingan tepung, agar menjadi tepung kulit pisang, (Dewati, 2008). 3.3.2 Hidrolisis Hidrolisis adalah suatu proses kimia yang menggunakan air sebagai pemecah suatu persenyawaan. Menyiapkan 3 erlenmeyer yang berisi sampel tepung kulit pisang sebanyak 100 g kemudian ditambahkan larutan H 2 SO 4 1000 ml dengan variasi konsentrasi H 2 SO 4 0,1, 0,3 dan 0,5M. Dipanaskan selama 120 menit dan diuji kadar glukosa menggunakan metode Luff Schoorl, (Retno dan Nuri, 2011) 3.3.3 Uji Glukosa Menggunakan Metode Luff-Schoorl Metode Luff Schoorl adalah berdasarkan proses reduksi dari larutan Luff Schoorl oleh gula pereduksi. Menyiapkan 3 erlenmeyer yang berisi filtrat dengan konsentrasi H 2 SO 4 0,1, 0,3, dan 0,5M sebanyak 3 ml dan diencerkan dengan aquadest hingga 50 ml. Mengambil 10 ml filtrat dari masing-masing erlenmeyer dan ditambahkan 10 ml larutan Luff-Schoorl. Dibuat pula perlakuan blanko yaitu 10 ml larutan Luff-Schoorl dengan 25 ml aquadest, dididihkan selama 2 menit dan cepat-cepat didinginkan, ditambahkan 15 ml KI 30% dan 25 ml H 2 SO 4 25%. Kemudian dititrasi dengan Natrium Tiosulfat sampai warna menjadi coklat muda selanjutnya ditambahkan indikator amilum sebanyak 1 ml. Perlakuan yang sama dilakukan pada filtrat dengan konsentrasi 0,3 dan 0,5 M, (Sudarmadji dkk, 1989).
20 3.3.4 Pembiakan Saccharomyces cerevisiae pada Media PDB dan PDA Menimbang PDB sebanyak 2,4 g dan ditambahkan aquadest sebanyak 100 ml selanjutnya dididihkan dan dimasukkan ke dalam autoclave sampai suhu 121 o C kemudian Saccharomyces cerevisiae dimasukkan ke dalam PDB dan ditumbuhkan selama 2 hari di shaker inkubator. Menimbang PDA sebanyak 1,08 g dan ditambahkan aquadest sebanyak 30 ml kemudian didihkan. Larutan PDA yang telah mendidih dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi masing-masing sebanyak 6 ml. Tabung reaksi ditutupi dengan kapas dan aluminium foil kemudian di sterilisasi menggunakan autoclave sampai suhu 121 o C. Disiapkan pembakar bunsen, jarum ose, 5 tabung reaksi yang berisi PDA dan alkohol. Jarum ose dibakar dan dicelupkan ke dalam PDB yang berisi Saccharomyces cerevisiae kemudian digoreskan pada PDA secara merata, diulangi perlakuan yang sama pada ke 4 tabung reaksi yang lain. Pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae dilakukan selama 2 hari, (Bustanussalam dkk, 2008). 3.3.5 Fermentasi dan Perhitungan Jumlah Saccharomyces cerevisiae Menyiapkan filtrat larutan H 2 SO 4 0,5 M sebanyak 700 ml ditambahkan ammonium sulfat 1,05 g dan urea 0,56 g sebagai nutrisi, kemudian diatur ph sampai 4,5 menggunakan NaOH 25%, filtrat di autoclave sampai suhu 121 o C. Pada 4 erlenmeyer dimasukkan filtrat sebanyak 175 ml dan ditambahkan Saccharomyces cerevisiae sebanyak 2 ose. Dilakukan perlakuan yang sama pada filtrat dengan label fermentasi hari ke 5, 7, dan 9. Erlenmeyer dimasukkan dalam inkubator pada suhu 30 o C.
21 Menyiapkan hasil fermentasi hari ke 3, tabung reaksi, cawan petri, pembakar bunsen, pipet mikro, vortex, gelas ukur, gelas kimia dan PDA 120 ml. Memasukkan 9 ml aquadest pada tabung reaksi kemudian di autoclave sampai suhu 121 o C, mengambil 1 ml cairan fermentasi hari ke 3 dan diencerkan secara bertingkat dari tabung reaksi pertama (10-1 ) sampai 10-8. Pengenceran dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan menggangu pengamatan). Menyiapkan 8 cawan petri yang telah diberi label 10-1 sampai 10-8, diambil 0,5 ml larutan dalam tabung reaksi yang berlabel 10-1, di vortex dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang berlabel 10-1, dilakukan juga perlakuan yang sama untuk 10-2 sampai 10-8. Kemudian ditambahkan 15 ml PDA dan dihomogenkan dengan cara memutarmutar cawan petri di atas meja seperti menuliskan angka delapan. Selanjutnya dimasukkan dalam inkubator pada suhu 30 o C selama 3 hari, setelah 3 hari dihitung jumlah koloni menggunakan alat colony counter. Perlakuan yang sama juga dilakukan pada hasil fermentasi hari ke 5, 7, dan 9. Pada hasil fermentasi hari ke 7 jumlah mikrobanya dihitung dari hari pertama sampai hari ke sepuluh untuk dibuat kurva pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae, (Idral dkk, 2012). 3.3.6 Destilasi Dan Pengukuran Kadar Etanol Hasil fermentasi hari ke 3, dimasukkan dalam labu leher tiga dan ditambahkan batu didih. Di destilasi pada suhu 78 o C dan destilatnya diukur menggunakan alkoholmeter. Selanjutnya dilakukan perlakuan yang sama pada hasil fermentasi hari ke 5, 7 dan 9.
22 3.3.7 Uji Etanol menggunakan Infra Merah Menyalakan alat Infra Merah dan menunggu selama beberapa menit sampai muncul warna hijau yang menandakan alat IR siap dipakai. Mengambil beberapa ml destilat menggunakan pipet mikro kemudian diletakkan pada alat dan akan dibaca oleh komputer.