8 II. MATERI DAN METODE PENELITIAN 1. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1.1 Materi Penelitian 1.1.1 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah jamur yang bertubuh buah, serasah daun, batang/ranting patah yang ditumbuhi jamur, kayu lapuk, dan tanah yang diperoleh di hutan lindung Resort Pemangkuan Hutan (RPH) Baturraden, Bagian Kesatuan Pemangkuan Hutan (BKPH) Gunung Slamet Barat, Perum Perhutani Kesatuan Pemangkuan Hutan (KPH) Banyumas Timur. Bahan yang digunakan untuk melakukan isolasi dan seleksi adalah aquades steril, medium PDA ( Potato Dextrose Agar), alkohol 70%, kloramfenikol, medium Bavendamm (PDA+ asam galat), asam asetat glasial 50%, dan formalin 37%. 1.1.2 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah masker, alat tulis, kamera digital, GPS (Global Positioning System), autoklaf, LAF (Laminar Air Flow), oven, kantong plastik (ukuran 2 kg, 3 kg, dan 5 kg), kertas label, timbangan analitik, cawan petri, jarum ose, pipet ukur (5 ml dan 10 ml), pipet tetes, skalpel, wrapper, pembakar spirtus, gelas benda (200 ml, 500 ml, dan 1000 ml), kapas, magnetik stirrer, labu Erlenmeyer 250 ml, batang pengaduk, bor gabus (diameter 4 mm), kompor gas, aluminium foil, kaca preparat, kaca objek, mikrometer okuler dan objektif, kertas tissue, kapas, tabung reaksi, mikroskop, dan pinset.
9 1.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Tahapan pengambilan sampel jamur dilakukan di hutan lindung RPH Baturraden, BKPH Gunung Slamet Barat, Perum Perhutani KPH Banyumas Timur pada tanggal 28 Juni 2013. Tahapan isolasi, seleksi, dan inventarisasi jamur pelapuk putih dilakukan pada bulan Juli 2013-Februari 2014 di Laboratorium Mikologi/Fitopatologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. 2. Metode Penelitian dan Cara Kerja 2.1 Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode survai dengan teknik pengambilan sampel secara acak terpilih ( Purposive Random Sampling) di hutan lindung RPH Baturraden, BKPH Gunung Slamet Barat, Perum Perhutani KPH Banyumas Timur. Identifikasi dilakukan pada sampel jamur yang didapat dari uji medium Bavendamm yang positif jamur pelapuk putih berdasarkan ciri morfologinya. 2.2 Parameter Parameter utama yang diamati adalah karakter mikromorfologi dan makromorfologi genus jamur pelapuk putih. Parameter pendukung yang diamati yaitu kecepatan pertumbuhan miselium pada medium agar, diameter koloni, pigmentasi medium berdasarkan uji medium Bavendamm, diameter hifa, dan hifa yang berseptat. 2.3 Cara Kerja 2.3.1 Pembuatan medium PDA (Potato Dextrose Agar) (Gandjar et al., 1999) terdapat pada Lampiran 1.
10 2.3.2 Pembuatan medium seleksi jamur pelapuk putih (medi um Bavendamm) (Nishida et al., 1988) terdapat pada Lampiran 2. 2.3.3 Pembuatan larutan awetan jamur pelapuk putih (larutan FAA/ Formaldehyde Acetic-acid Alcohol) (Gandjar et al., 1999) terdapat pada Lampiran 3. 2.3.4 Pengambilan Sampel (Arif et al., 2008) Sampel jamur diambil secara acak terpilih ( Lampiran 4. Peta Pengambilan Sampel Jamur Pelapuk Putih), dengan mencari dan mengumpulkan jamur bertubuh buah, material atau bahan isolat : tanah yang mengandung serasah atau bahan organik, ranting/batang yang ditumbuhi jamur, dan kayu yang sudah lapuk di sepanjang jalur pendakian Gunung Slamet. Sebelum dibawa ke laboratorium, setiap sampel jamur diamati secara visual dan didokumentasikan. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam plastik dan diberi label untuk selanjutnya dibawa ke laboratorium dan dilakukan tahapan selanjutnya. 2.3.5 Isolasi jamur pelapuk putih, seleksi isolat jamur pelapuk putih, identifikasi, dan koleksi jamur pelapuk putih. 2.3.5.1. Isolasi jenis-jenis jamur yang diperoleh dari lapangan dilaksanakan di laboratorium, dengan tahapan: 2.3.5.1.1 Isolasi jamur dari tubuh buah jamur, kayu lapuk, serasah daun, batang dan ranting (Arif et al., 2008) Metode ini digunakan pada sampel jamur yang sudah membentuk tubuh buah, kayu lapuk, serasah daun, ranting dan batang (yang ditumbuhi jamur). Sampel yang sudah dipotong kecil ± 1 cm sebelum dibiakkan dilakukan sterilisasi permukaan dengan memasukkannya ke dalam larutan alkohol 70% selama 1 menit, kemudian dibilas dengan akuades steril ± 5 detik dengan tiga kali
11 ulangan, setelah itu dikeringkan dengan tissue steril ± 1 menit. Selanjutnya ditanam ke medium PDA di dalam cawan petri. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 3-4 hari sampai terlihat adanya pertumbuhan miselium jamur. Biakkan campuran yang tumbuh selanjutnya dimurnikan pada medium PDA yang baru, dengan cara memindahkannya menggunakan jarum ose. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 4-5 hari sampai terlihat adanya pertumbuhan jamur tunggal. Jamur tunggal yang didapat ditumbuhkan kembali pada medium PDA yang baru, dengan cara memindahkannya menggunakan bor gabus berdiameter 4 mm untuk pengukuran kecepatan pertumbuhan miselium dan diameter koloni selama 7 hari. 2.3.5.1.2. Isolasi dengan pengenceran (Arif et al., 2008) Metode ini digunakan pada sampel yang berasal dari tanah. Prosedur isolasi diawali dengan pengambilan sampel tanah sebanyak 1 gram (steril) yang sudah di-oven selama 30 menit pada suhu 80 o C, kemudian dilarutkan kedalam 9 ml akuades steril pada tabung reaksi, dihomogenkan dengan mengocoknya sampai tercampur. Pengenceran dilakukan dengan cara mensuspensikan 1 ml ke dalam 9 ml akuades steril dan seterusnya sampai pada pengenceran 10-7. Sebanyak 0,1 ml diambil dari kedua pengenceran terakhir (10-6 dan 10-7 ) yang telah homogen, dituang pada cawan petri yang berisi medium PDA, selanjutnya diratakan. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama ± 7 hari sampai terlihat adanya pertumbuhan miselium jamur. Biakan campuran yang tumbuh
12 selanjutnya dimurnikan pada medium PDA yang baru, dengan cara memindahkannya menggunakan jarum ose. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 7 hari sampai terlihat adanya pertumbuhan jamur tunggal. Jamur tunggal yang didapat ditumbuhkan kembali pada medium PDA yang baru, dengan cara memindahkannya menggunakan bor gabus berdiameter 4 mm untuk pengukuran kecepatan pertumbuhan miselium dan diameter koloni selama 7 hari. 2.3.5.2. Seleksi jamur pelapuk putih (Musa et al., 2011) Jamur tunggal (murni) yang diperoleh dari hasil isolasi kemudian diinokulasikan ke dalam cawan yang sudah berisi medium Bavendamm. Cawan diinkubasi di tempat gelap (kotak tertutup) selama ± 7 hari, apabila pada medium tidak terbentuk warna coklat berarti uji Bavendamm negatif (-), artinya jamur tersebut tidak dapat mengoksidasi asam galat sehingga jamur ini dapat dikelompokkan ke dalam jamur pelapuk coklat. Apabila terbentuk warna coklat pada medium, berarti uji Bavendamm positif (+), artinya jamur tersebut dapat mengoksidasi asam galat sehingga jamur ini dapat dikelompokkan ke dalam jamur pelapuk putih. 2.3.5.3. Identifikasi dan koleksi jamur pelapuk putih. 2.3.5.3.1. Idenifikasi jamur pelapuk putih (Arif et al., 2008; Musa et al., 2011) Identifikasi dilakukan dengan mengamati ciri makroskopis dan mikroskopis jamur. Ciri makroskopis yang diamati adalah warna permukaan koloni (tampak atas dan tampak bawah), diameter koloni, dan kecepatan pertumbuhan miselium. Pengamatan ciri
13 mikroskopis mencakup diameter hifa dan hifa yang berseptat. Identifikasi dan pengukuran diameter hifa jamur dilakukan dengan meletakkan 1 ose hifa jamur yang tumbuh pada medium PDA di atas kaca obyek yang telah ditetesi medium PDA yang sudah memadat kemudian ditutup dengan kaca objek. Preparat tersebut diletakkan ke dalam cawan petri dan diberi pelembab berupa tissue steril yang dibasahi dengan akuades steril. Diinkubasi selama ± 2-3 hari, setelah itu, diameter hifa diukur dengan menggunakan mikrometer okuler dan pengamatan ciri mikromorfologi lainnya untuk membantu mempermudah identifikasi. Identifikasi dilakukan dengan mencocokkan ciri-ciri makromorfologi dan mikromorfologi yang diperoleh dengan mengacu pada buku identifikasi jamur, yaitu Domsch dan Gams (1970 dan 1980), Burnett dan Hunter (1972), dan Gandjar et al., (1999) sampai tingkat genus. Identifikasi hanya dilakukan pada isolat jamur yang memberikan hasil positif pada uji Bavendamm. Kemudian mendokumentasikan sampel jamur yang didapat menggunakan kamera digital. 3.5.3.3.2. Koleksi jamur pelapuk putih (Subowo, 1992) Jamur bertubuh buah yang telah diisolasi, memberikan hasil positif pada medium uji bavendamm, dan sudah diidentifikasi, dibersihkan dari kotoran, kemudian dimasukkan dalam larutan awetan FAA ( Formaldehyde Acetic-acid Alcohol) sebagai awetan basah, begitu juga isolat jamur hasil seleksi uji Bavendamm dijadikan koleksi laboratorium. Koleksi dilakukan dengan
14 memberikan tanggal koleksi, nama genus, asal pengambilan sampel, dan ciri khas atau spesifik dari identifikasi jamur pelapuk putih. 3. Metode Analisis Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif. Untuk memperjelas hasil pengamatan visual, dibuat dokumentasi dalam bentuk foto makromorfologi dan mikromorfologi.