BAB II TINJAUAN PUSKATA 2.1 Lemak Lipida adalah senyawa organik yang terdapat dalam makhluk hidup yang tidak larut di dalam air tetapi larut di dalam pelarut non-polar seperti heksan, dietil eter. Komponen utama lipida adalah lemak, lebih 95% lipida adalah lemak. Lemak adalah triester asam lemak dan gliserol. Nama kimia dari lipida adalah triasilgliserol (TAG). Nama lain yang sering digunakan adalah trigliserida (McKee dan McKee, 2003). Struktur kimia lemak ( triasilgliserol) dapat dilihat pada Gambar 2.1 H O H C α O C (CH 2 ) 14 CH3...(α ) palmitat atau posisi sn-1 O H C β O C (CH 2 ) 16 CH 3...(β) stearat atau posisi sn-2 O H C α O C (CH 2 ) 14 CH 3...(α ) palmitat atau posisi sn-3 H 1,3-dipamitoil, 2-stearoil gliserol (PSP) Gambar 2.1 Struktur Kimia Lemak (Triasilgliserol) (Sumber: Berry, 2009) O Keterangan: R C disebut dengan gugus asil, yang mengikat molekul gliserol dengan 3 asam lemak. Contoh: palmitat, stearat, oleat disebut trigliserida maka struktur kimia tersebut dinamakan palmitoil/stearoil/oleoil. Lemak dapat dibagi berdasarkan komposisi asam lemak yang dikandungnya yaitu lemak jenuh dan lemak tak jenuh. Lemak jenuh adalah lemak yang mengandung asam lemak jenuh lebih dari 60%, sedangkan lemak tak jenuh mengandung asam lemak tak jenuh di atas 60%. Biasanya lemak nabati adalah lemak tak jenuh dan cair pada suhu kamar sehingga disebut minyak kecuali
minyak kelapa dan minyak inti sawit karena banyak mengandung asam lemak rantai sedang. Sebaliknya, lemak hewani termasuk lemak jenuh dan berwujud padat pada suhu kamar dan disebut sebagai lemak kecuali minyak ikan karena mengandung asam lemak tak jenuh (McKee dan McKee, 2003). Sebagai bagian dari makanan, minyak dan lemak yang mempunyai fungsi nutrisi dan peranan fungsional. Berdasarkan ilmu gizi, lemak dan minyak mempunyai lima fungsi yakni, sebagai (1) bahan pembentuk struktur sel, (2) sumber asam lemak esensial untuk manusia, (3) pelarut vitamin A, D E dan K, (4) mengontrol lipida dan lipoprotein serum dan (5) sumber energi. Minyak dan lemak komponen pangan yang paling banyak mengandung energi sebesar 9 kalori per gram, sedangkan protein dan karbohidrat mengandung energi kira-kira setengahnya. Lemak juga membantu penyerapan vitamin yang larut dalam lemak; vitamin A, D, E dan K. Beberapa asam lemak berfungsi sebagai bahan baku untuk mensintesis prostaglandin yang mengatur berbagai fungsi fisiologis. Lemak sangat vital untuk pertumbuhan dan perkembangan pada manusia (Silalahi, 2006). Di samping berbagai fungsi nutrisi, sebagai komponen bahan makanan, minyak dan lemak memiliki peran fungsional yang penting dan sebagai pemberi cita rasa dalam produk makanan. Lemak berperan dalam penampilan makanan, rasa enak, konsistensi atau tekstur, lubrikasi makanan dan meningkatkan rasa kenyang sesudah makan. Lemak juga dapat membawa aroma dari senyawa yang larut dalam lemak (Silalahi, 2006). Sifat kimia, fisika dan biokimia (metabolisme dan sifat aterogenik) dari suatu lemak ditentukan oleh komposisi dan posisi (sn-1, sn-2 dan sn-3) asam lemak yang teresterkan di dalam molekul (triasilgliserol). Walaupun minyak A
dan B memiliki komposisi asam lemak yang sama belum tentu memiliki sifat aterogenik yang sama. Perbedaan sifat ini terjadi karena metabolismenya dan cara mengetahui kadar lipoprotein kolesterol dalam darah berbeda (Bruckner, 2008; Silalahi dan Nurbaya, 2011). 2.1.1 Asam Lemak di dalam Lemak Asam lemak adalah asam monokarboksilat rantai lurus tanpa cabang yang mengandung atom karbon genap mulai dari C-4, tetapi yang paling banyak adalah C-16 dan C-18. Asam lemak digolongkan menjadi tiga yaitu berdasarkan panjang rantai asam lemak, tingkat kejenuhan, dan bentuk isomer geometrisnya. Berdasarkan panjang rantai asam lemak dibagi atas; asam lemak rantai pendek (SCFA) mempunyai atom karbon lebih rendah dari 8, asam lemak rantai sedang mempunyai atom karbon 8 sampai 12 (MCFA) dan asam lemak rantai panjang mempunyai atom karbon 14 atau lebih (LCFA). Semakin panjang rantai C yang dimiliki asam lemak, maka titik lelehnya akan semakin tinggi (Silalahi, 2000; Silalahi dan Tampubolon, 2002). Berdasarkan ada tidaknya ikatan rangkap, asam lemak terdiri asam lemak jenuh, dapat dibagi atas empat golongan; asam lemak jenuh ( SFA), asam lemak tak jenuh tunggal (MUFA), asam lemak tak jenuh ganda (PUFA), juga dikenal asam lemak tak jenuh cis dan trans-isomer. Secara alamiah bisanya asam lemak tak jenuh berada sebagai bentuk cis-isomer, hanya sedikit bentuk trans (TFA) (Silalahi, 2000; White, 2009). Kelompok asam lemak yang meningkatkan kadar kolesterol dalam darah adalah SFA dan asam lemak trans. Asam lemak ini menyebabkan kenaikan kadar
kolesterol total terutama pada LDL. Asam lemak jenuh yang paling banyak dalam diet adalah asam palmitat (C-16:0) baik dalam produk nabati (minyak kedelai) maupun hewani (produk susu dan daging), asam lemak ini juga mempunyai potensi yang kuat dalam meningkatkan LDL. Asam lemak jenuh lainnya, asam miristat (C-14:0), terdapat dalam jumlah yang lebih kecil dalam diet, tetapi mempunyai potensi yang kuat dari pada asam palmitat dalam meningkatkan LDL. Asam lemak rantai pendek (<10 rantai karbon) kurang mempengaruhi kadar kolesterol dalam darah, sedangkan asam stearat (C-18:0), tidak meningkatkan kolesterol LDL karena dengan cepat akan diubah menjadi asam oleat, sehingga dianggap netral (Uauy, 2009). MUFA tidak mempengaruhi LDL, sedangkan PUFA dapat menurunkan LDL (Decker, 1996; Grundy, 1999; Uauy, 2009; White, 2009). 2.1.2 Metabolisme Lemak Metabolisme dan daya cerna lemak dipengaruhi oleh panjang rantai asam lemak dan posisi asam lemak di dalam molekul TAG. Enzim lipase adalah sekelompok enzim yang bertanggung jawab pada metabolisme lemak dalam pencernaan manusia. Ada tiga sumber lipase yang aktif menghidrolisa lemak sebelum diabsorpsi. Enzim lipase pada manusia bekerja secara spesifik pada posisi sn-1 dan sn-3, dan tidak menghidrolisa asil pada posisi sn-2 atau pada atom karbon nomor 2. Pada dasarnya hidrolisa lemak dimulai oleh lingual lipase dalam mulut terutama pada bayi tetapi aktivtas ini rendah pada orang dewasa. Enzim ini aktif dalam bagian atas pencernaan, menghidrolisa lemak (TAG) menjadi MAG, DAG, dan FFA. Selain daripada itu lingual lipase cendrung akan menghidrolisa asam lemak rantai pendek dan sedang saja (Silalahi dan Nurbaya, 2011).
Bagan metabolisme dan transportasi triasilgliserol pada manusia dapat dilihat pada Gambar 2.2. TAG Mulut Lipase air liur MCFA MCFA, MAG, Jaringan Hati MCFA ( C12) DAG, FFA Lambung MCFA, MAG, DAG, FFA Usus halus Lipase lambung Lipase pankreatik FFA, 2-MAG Jantung Sistem limpatik Lapisan mukosa usus Gambar 2.2 Metabolisme dan transportasi triasilgliserol pada manusia (sumber: Silalahi dan Nurbaya, 2011) Asam lemak rantai pendek dan sedang akan mudah berinteraksi dengan medium berair sehingga dapat langsung diserap melalui lambung ke sirkulasi via vena porta ke hati, dimana akan terjadi oksidasi dan menghasilkan kalori sehingga tidak bersifat aterogenik seperti yang terjadi terhadap minyak kelapa (Willis, et al., 1998; Willis dan Marangoni, 1999; Enig, 1996; Enig, 2010). Hal ini terutama penting pada pasien yang penyerapan lemak yang tidak baik (fat malabsorption) dan juga untuk menghasilkan energi yang cepat untuk bayi yang prematur. Asam lemak rantai pendek dan sedang juga dapat dimanfaatkan untuk mensuplai energi yang cepat dalam otot karena transportasi ke mitokondria tidak memerlukan carnitin (Willis dan Marangoni, 1999). Di dalam lambung lemak akan dihidrolisa oleh lipase lambung (gastric lipase) yang juga aktif terhadap asam lemak rantai pendek dan sedang, kemudian dapat memasuki sirkulasi via
vena porta juga langsung ke hati. Lipase pankreas (pancreatic lipase) yang berada di dalam usus halus akan mengkataliser hidrolisa tahap terakhir dari lemak yang sedikit lebih aktif terhadap asam lemak pada posisi sn-1. Lipase pankreas walaupun lebih cendrung terhadap asam lemak pendek dan sedang tetapi dapat juga menghidrolisis asam lemak panjang yang berada pada posisi sn-1,3 (Silalahi, 2006; Silalahi dan Nurbaya, 2011). Setelah hidrolisis asam lemak dan 2-MAG dalam bentuk misel bersama dengan garam empedu diabsorpsi melalui mukosa intestinal. Asam lemak rantai sedang dalam bentuk 2-MAG diserap, kemudian kembali ke dalam bentuk trigliserida lalu bercampur dengan kilomikron, dan diangkut melalui saluran limpa. Asam lemak jenuh rantai panjang dalam bentuk bebasnya tidak atau sedikit saja diserap, karena titik leleh yang tinggi akan berupa zat padat dan dapat bereaksi dengan kalsium dan magnesium membentuk garam atau sabun yang tak larut dalam air. Oleh karena itu, diupayakan untuk menempatkan asam lemak yang bermanfaat bagi kesehatan pada posisi sn-2 agar absorbsinya lebih baik (Willis, et al., 1988; Willis dan Marangoni, 1999). MAG yang diserap ini akan merupakan dasar struktur untuk mensintesis TAG dalam enterosit sehingga penyerapan asam lemak sn-2 pada lemak akan dipertahankan dan mempengaruhi metabolisme kilomikron dan remnan (sisa) kilomikron yang terbentuk sesudah hidrolisa TAG kilomikron. Asam palmitat dan stearat pada posisi sn-2 dari TAG kilomikron ternyata memperlambat lipolisis TAG dibandingkan dengan jika pada posisi 1 dan 3 (Robinson, et al., 2009; Berry, 2009; Wardlaw dan Hampl, 2007).
2.2 Aterosklerosis Aterosklerosis adalah penumpukan endapan jaringan lemak (atheroma) dalam nadi. Zat-zat yang merangsang terbentuknya aterosklerosis disebut aterogenik. Pengendapan lemak seperti ini disebut plak, terutama terdiri dari kolesterol dan esternya, dan cenderung terjadi di titik-titik percabangan nadi sehingga mengganggu aliran darah di tempat-tempat yang memiliki aliran darah yang tidak begitu deras. Nadi-nadi tertentu rentan terhadap plak, terutama nadinadi koroner yang memasok darah ke otot-otot jantung, nadi-nadi yang memasok darah ke otak, dan nadi-nadi pada kaki (Silalahi, 2006). Aterosklerosis terbagi atas tiga tahap yaitu tahap pembentukan sel busa, pembentukan plak pada jaringan, dan lesi majemuk. Tahap awal aterosklerosis disebabkan oleh adanya kadar LDL yang tinggi pada sirkulasi, LDL ini dapat terjebak di dalam intima dan akan mengalami oksidasi. Peristiwa oksidasi ini akan merangsang permukaan sel untuk menarik monosit ke dalam intima. Di dalam intima monosit akan berubah menjadi makrofag yang akan memakan LDL teroksidasi. Makin banyak LDL yang dimakan menyebabkan makrofag penuh sehingga makrofag akan terbentuk seperti busa. Pada tahap berikutnya pertumbuhan sel otot polos pada pembuluh darah dari lapisan tengah menuju bagian dalam dinding pembuluh. Pertumbuhan ini akan menyebabkan terbentuknya plak dan akan mengakibatkan penyempitan lumen pembuluh darah. Makin lama pembuluh sel akan makin besar dan akan memperkecil lumen. Selanjutnya plak makin majemuk dengan terjadinya penambahan kalsium dan unsur-unsur lain yang dibawa oleh darah. Ini dapat mengakibatkan sobekan dan pendarahan, ini merupakan tahap lesi majemuk (Silalahi, 2006).
2.2.1 Hiperlipidemia dan terjadinya ateroklerosis Peningkatan kadar kolesterol (hiperlipidemia) sebagai faktor utama pada proses terjadinya aterosklerosis. Komponen lipida termasuk kolesterol, karena tidak larut dalam air, diangkut dalam sistem sirkulasi darah dalam bentuk kompleks lipida dan protein yang disebut misel lipoprotein, yaitu sebagai VLDL, LDL, dan HDL (Chow, 2008). Variasi kadar total kolesterol, LDL dan HDL dapat dilihat pada Tabel 2.1. Tabel 2.1 Variasi kadar total kolesterol, LDL, dan HDL. Lipida Kondisi Total Kolesterol (mg/dl) < 200 Normal 200-240 Agak tinggi >240 Tinggi LDL (mg/dl) <100 Normal 100-129 Baik 130-159 Agak tinggi 160-190 Tinggi >190 Sangat tinggi HDL (mg/dl) <40 Rendah >60 Tinggi Sumber: Rinzler, 2002 Peningkatan kadar kolesterol LDL membanjiri sifat antioksidan dan endothelium yang sehat. LDL yang teroksidasi akan merusak sel dan
menyebabkan disfungsi dinding pembuluh darah dan akhirnya memicu aterosklerosis (Silalahi, 2006; Vasudevan, 2009). Kolesterol adalah lipida struktural (pembentuk struktur sel) yang berfungsi sebagai komponen yang dibutuhkan dalam kebanyakan sel tubuh. Kolesterol merupakan bahan yang menyerupai lilin, 80% dari kolesterol diproduksi oleh liver dan selebihnya didapat dari makanan yang kaya akan kandungan kolesterol seperti daging, telur dan produk berbahan dasar susu. Dari segi kesehatan, kolesterol sangat berguna dalam membantu pembentukan hormon atau vitamin D, membantu pembentukan lapisan pelindung disekitar sel syaraf, membangun dinding sel, pelarut vitamin (vitamin A, D, E, K) dan pada anak-anak dibutuhkan untuk mengembangkan jaringan otaknya (Silalahi, 2006). Kolesterol diabsorpsi di usus dan ditranspor dalam bentuk kilomikron menuju hati. Dari hati, kolesterol dibawa oleh VLDL untuk membentuk LDL melalui perantara IDL. LDL akan membawa kolesterol ke seluruh jaringan perifer sesuai dengan kebutuhan. Sisa kolesterol di perifer akan berikatan dengan HDL dan dibawa kembali ke hati agar tidak terjadi penumpukan di jaringan. Kolesterol yang ada di hati akan diekstraksi menjadi asam empedu yang sebagian dikeluarkan melalui feses, sebagian asam empedu diabsorpsi oleh usus melalui vena porta hepatik yang disebut dengan siklus enterohepatik. Bila kadar yang dimiliki melebihi kadar normalnya dapat menyebabkan gangguan dalam tubuh (Silalahi, 2006). 2.2.2 Sifat Aterogenik Lemak Asam lemak rantai pendek dan sedang akan mudah berinteraksi dengan medium berair sehingga dapat langsung melalui lambung ke sirkulasi via vena
porta ke hati, dimana akan terjadi oksidasi dan menghasilkan kalori sehingga tidak bersifat aterogenik seperti yang terjadi terhadap minyak kelapa (Silalahi dan Nurbaya, 2011). Di dalam lambung lemak akan dihidrolisis oleh lipase lambung (gastric lipase) yang juga aktif terhadap asam lemak rantai pendek dan sedang, kemudian dapat memasuki sirkulasi via vena porta juga langsung kehati. Lipase pankreas (pancreatic lipase) yang berada dalam usus halus akan mengkatalisis hidrolisis tahap terakhir dari lemak yang sedikit lebih aktif terhadap asam lemak pada posisi sn-1. Lipase pankreas walaupun lebih cenderung terhadap asam lemak pendek dan sedang tetapi juga dapat menghidrolisis asam lemak panjang yang berada pada posisi sn-1,3. Asam lemak jenuh rantai panjang dalam bentuk bebasnya tidak atau sedikit saja diserap, karena titik leleh yang tinggi akan berupa zat padat dan dapat bereaksi dengan kalsium dan magnesium membentuk garam atau sabun yang tak larut dalam air. Asam lemak rantai panjang seperti asam palmitat (C-16) pada posisi sn-2 tidak dapat dihidrolisis oleh enzim lipase dalam proses metabolisme manusia sehingga diserap sempurna oleh tubuh dan pada akhirnya dapat memicu aterosklerosis (Silalahi, 2006). 2.3 Minyak Kelapa dan Minyak Kedelai Minyak kelapa adalah salah satu lemak nabati yang diperoleh dari buah kelapa. Dikenal dua jenis minyak kelapa, miyak kelapa biasa atau minyak kelapa yang digunakan untuk menggoreng dan minyak kelapa murni yang dikenal dengan VCO. Minyak kelapa biasa diperoleh dari kopra dengan cara pemanasan dan pemurnian dengan bahan kimia sedangkan VCO diperoleh dari buah kelapa segar tanpa proses pemanasan. Komposisi asam lemak VCO dan minyak kelapa biasa tidak berbeda. Akan tetapi, VCO karena dibuat tanpa pemanasan, masih
mengandung antioksidan alami dan zat lainnya sehingga sedikit berbeda dengan minyak kelapa biasa. Maka VCO biasanya tidak digunakan untuk menggoreng tetapi langsung diminum sebagai makanan fungsional/ makanan kesehatan (Silalahi, 2006; Silalahi dan Nurbaya 2011). Komponen minyak kelapa terdiri dari asam lemak jenuh (90%) dan asam lemak tak jenuh (10%). Dalam minyak kelapa murni terdapat MCFA. MCFA merupakan komponen asam lemak berantai sedang yang memiliki banyak fungsi, antara lain mampu merangsang produksi insulin sehingga proses metabolisme glukosa dapat berjalan normal. Selain itu MCFA juga bermanfaat dalam mengubah protein menjadi sumber energi. Minyak kelapa murni juga mengandung asam laurat dan asam lemak jenuh berantai pendek, seperti asam kaproat dan kaprilat yang berperan positif dalam proses pembakaran nutrisi makanan menjadi energi. (Silalahi, 2006). Komposisi asam lemak minyak kelapa dan minyak kedelai dapat dilihat pada Tabel 2.2. Tabel 2.2 Komposisi asam lemak Minyak Kelapa dan Minyak Kedelai No Asam Lemak Minyak Kelapa Minyak Kedelai 1 Asam kaprilat (C8 : 0) 7,6 % 2 Asam kaprat (C10 : 0) 7,3 % 3 Asam laurat (C12 : 0) 48,2 % 4 Asam miristat (C14 : 0) 16,6 % 0,2 % 5 Asam palmitat (C16 : 0) 8,0 % 10,5 % 6 Asam stearat (C18) 3,3 % 3,2 % 7 Asam oleat (C18 : 1) 5,0 % 22,3 % 8 Asam linoleat (C18 : 2) 2,5 % 54,5 %
9 Asam linolenat (C18:3) 8,3 % Sumber: Weiss (1983) ; Ong, et al. (1995) Kandungan minyak dan komposisi asam lemak dalam kedelai dipengaruhi oleh varietas dan keadaan iklim tempat tumbuh. Lemak kasar terdiri dari trigliserida sebesar 90-95 persen, sedangkan sisanya adalah fosfatida, asam lemak bebas, sterol dan tokoferol. Minyak kedelai mempunyai kadar asam lemak jenuh sekitar 15% sehingga sangat baik sebagai pengganti lemak dan minyak yang memiliki kadar asam lemak jenuh yang tinggi seperti mentega dan lemak babi. Hal ini berarti minyak kedelai sama seperti minyak nabati lainnya yang bebas kolestrol (Semon, et al., 2006). Kadar minyak kedelai relatif lebih rendah dibandingkan dengan jenis kacang-kacangan lainnya, tetapi lebih tinggi daripada kadar minyak serelia. Kadar protein kedelai yang tinggi menyebabkan kedelai lebih banyak digunakan sebagai sumber protein daripada sebagai sumber minyak. Asam lemak dalam minyak kedelai sebagian besar terdiri dari asam lemak esensial yang sangat dibutuhkan oleh tubuh (Semon, et al., 2006). 2.4 Sifat Aterogenik Minyak Kelapa dan Minyak Kedelai Menurut Ancel Keys 1953-1957, menyampaikan anti lemak jenuh, secara berturut-turut menyatakan bahwa semua lemak baik dari hewan dan nabati tidak berbeda dalam hal pengaruhnya terhadap resiko penyakit jantung koroner, lemak jenuh menaikkan kolesterol sedangkan asam lemak tak jenuh ganda misalnya minyak kedelai menurunkan. Minyak kelapa yang juga adalah disinyalir akan
menaikkan LDL yang dapat meningkatkan resiko penyakit jantung koroner (Enig, 1996). Beberapa penelitian terdahulu juga mengatakan bahwa pada dinding pembuluh darah (ateroma) yang menderita aterosklerosis hanya 3,0% mengandung komposisi asam lemak VCO (asam laurat) ini menyatakan bahwa VCO tidak ikut mengendap dalam darah. Plak tersebut didominasi oleh asam palmitat (46%) dan asam stearat (34%) (Vasudevan, 2009). Hasil penelitian lain menunjukkan bahwa apabila VCO digantikan dengan minyak jagung maka kadar total kolesterol menurun hingga 18,7%, dan HDL menurun hingga 41,4% sehingga rasio LDL/HDL meningkat sampai 30% hal ini berarti akan meningkatkan resiko penyakit jantung koroner, pada VCO menunjukkan total kolesterol meningkat sedikit 1,9%, LDL menurun 0,1%, HDL meningkat 6,3%, sehingga rasio LDL dan HDL menurun 2,4% hal ini menunjukkan bahwa resiko penyakit jantung koroner berkurang (Enig, 2010). 2.5 Pengukuran Lipida Darah Kolesterol total dan trigliserida diukur dengan metode enzimatis dan metode Liebermann-Buchards. HDL dapat diukur dengan metode presipitasi dan metode langsung. LDL dapat dihitung dengan rumus Friedewald dan dapat diukur dengan metode langsung, untuk lebih jelasnya diuraikan dalam sub bab berikut ini: 2.5.1 Kolesterol Penetapan kadar kolesteroll serum dengan metode enzimatik CHOD PAP dengan prinsip penguraian kolesterol dan esternya menjadi peroksida dengan
hidrolisis dan oksidasi enzimatik yang mengubah subtrat menjadi kromofor sehingga kadarnya dapat diukur secara spektrofotometri (Anonim, 2010). Kolesterol ester + H 2 O Kolesterol ester + O 2 kolesterol esterase kolesterol oksidase kolesterol + asam lemak kolesten-3-one + H 2 O 2 2 H 2 O 2 + fenol + 4-aminoantipyrin peroksidase quinoneimine + 4 H 2 O Prosedur analisis yaitu sampel atau standar diambil sebanyak 100 µl dan dicampurkan dengan 1000 µl pereaksi kit (mengandung kolesterol esterase, kolesterol oksidase, fenol, 4-aminoantipyrin, peroksidase) kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu dicampurkan sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu kamar selama 20 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm. Perhitungan kadar kolesterol total dilakukan dengan menggunakan rumus (Prangdimurti, et al., 2007): Kadar kolesterol (mg/dl): [absorbansi sampel] standar [absorbansi standar] kandungan kolesterol yang diketahui (mg/dl) Metode lain untuk analisis kadar kolesterol adalah dengan metode Liebermann-Buchards yaitu dengan cara ke dalam tabung sentrifugasi 15 ml diisikan 12 ml campuran alkohol-eter, kemudian dimasukkan 0,01 g sampel padat, diaduk perlahan sampai homogen. Tabung ditutup rapat dan dikocok kuat selama 1 menit dengan vortex. Tabung disentrifugasi selama 3 menit dan supernatannya dipindahkan ke dalam gelas piala ukuran 50 ml lalu diuapkan di atas penangas mendidih hingga kering. Residu kering ditambahkan kloroform 2-2,5 ml dan dikocok perlahan agar larut. Ekstrak dipindahkan secara kuantitatif ditambahkan 2 ml asetat anhidrida dan 0,1 ml asam sulfat pekat, dan dikocok dan ditepatkan
menjadi 5 ml dengan kloroform. Tabung di simpan diruang gelap selama 15 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 429 nm (Prangdimurti, 2007; Jensen, et al., 2002). 2.5.2 Trigliserida Metode yang digunakan untuk pengukuran trigliserida adalah dengan metode enzimatik kolorimetrik GPO. Prinsip dasar reaksi Colorimetric Enzimatic Test adalah sebagai berikut: Trigliserida Lipoprotein Lipase Glycerol + asam lemak Glycerol + ATP Gliserokinase Glycerol-3-Phospate + ADP Glycerol-3-Phospate + O 2 GPO Dihydroxyaceton Phospate + H 2 O 2 H 2 O 2 + aminoantipyrin + 4-Chloropenol peroksidase Chinonimine + HCl + 4 H 2 O 2 Prosedur analisis yaitu sampel atau standar diambil sebanyak 100 µl dan dicampurkan dengan 1000 µl pereaksi kit (mengandung lipoprotein lipase, ATP (Adeno-3-Phospate), gliserokinase, glycerol-phospate-oxidase, aminoantipyrine, 4-chlorophenol, peroksidase) kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu dicampurkan sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu kamar selama 20 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm. Perhitungan kadar trigliserida dilakukan dengan menggunakan rumus (Prangdimurti, et al., 2007): Kadar trigliserida (mg/dl): [absorbansi sampel] [absorbansi standar] kandungan trigliserida standar yang diketahui (mg/dl)
Metode lain untuk analisis kadar trigliserida adalah dengan metode Liebermann-Buchards yaitu dengan cara ke dalam tabung sentrifugasi 15 ml diisikan 12 ml campuran alkohol-eter, kemudian dimasukkan 0,01 g sampel padat, diaduk perlahan sampai homogen. Tabung ditutup rapat dan dikocok kuat selama 1 menit dengan vortex. Tabung disentrifugasi selama 3 menit dan supernatannya dipindahkan ke dalam gelas piala 50 ml lalu diuapkan di atas penangas mendidih hingga kering. Residu kering ditambahkan kloroform 2-2,5 ml dan dikocok perlahan agar larut. Ekstrak dipindahkan secara kuantitatif ditambahkan 2 ml asetat anhidrida dan 0,1 ml asam sulfat pekat, dan dikocok dan ditepatkan menjadi 5 ml dengan kloroform. Tabung disimpan diruang gelap selama 15 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 429 nm (Prangdimurti, 2007; Jensen, et al., 2002). 2.5.3 High Density Lipoprotein Pengukuran HDL dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan presipitasi terhadap lipoprotein densitas rendah (LDL dan VLDL) dan kilomikron. Presipitasi dilakukan dengan penambahan asam fosfotungstat dan kehadiran ion magnesium klorida (MgCl 2 ). Setelah disentrifugasi, HDL dalam supernatan diukur menggunakan pereaksi kit yang sama dengan pengukuran kolesterol total (Prangdimurti, et al., 2007; Jensen, et al., 2002). Prosedur presipitasi adalah sebagai berikut: sebanyak 200 µl serum darah dicampurkan dengan 500 µl pereaksi presipitasi yang telah diencerkan dengan akuabides (rasio 4+1), kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah sentrifugasi pada 1047 g (4000 rpm) selama 10 menit, dihasilkan
supernatan yang siap untuk dianalisis seperti analisis kolesterol total diatas (Prangdimurti, et al., 2007; Jensen, et al., 2002). Selain menggunakan metode presipitasi, cara lain dalam mengukur profil HDL adalah dengan pengukuran langsung (directly measured) dengan prinsip immuniinhibition. Metode ini menggunakan PEG yang dimodifikasi dengan enzim cholesterol esterase dan cholesterol oxidase menunjukkan aktifitas katalis selektif untuk fraksi lipoprotein, dalam hal ini ion magnesium, α-siklodekstrin sulfat menurunkan reaktifitas kolesterol sehingga tidak membutuhkan pengendapan (Jensen, et al., 2002). 2.5.4 Low Density Lipotrotein Teknik yang paling banyak digunakan oleh laboratorium klinik untuk mengukur kadar LDL pasien yaitu dengan menggunakan rumus Friedewald sebagai berikut dimana diasumsikan bahwa TG/5 merupakan kadar VLDL, yaitu: kadar LDL = Kolesterol total HDL - TG/5 (Friedewald, et al., 1972). Selain dengan perhitungan dengan menggunakan rumus Friedewald, LDL dapat diukur dengan metode pengukuran langsung (directly measured) dengan prinsip enzymatic selective protection, metode ini dengan menggunakan surfaktan non-ionik untuk melarutkan LDL sedangkan untuk meningkatkan reaktifitas kolesterol untuk penentuan secara enzimatik dengan menggunakan cholesterol esterase-cholesterol oxidase (Jensen, et al., 2002).