LAPORAN TEKNIS Pengembangan Kualitas Teknik FISH dengan Variasi Dual Probe Yanti Lusiyanti Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi I. PENDAHULUAN. Ketika tubuh terpapar radiasi pengion, dipastikan akan terjadi perubahan pada materi biologis tubuh, paling tidak pada tingkat molekuler khususnya materi genetik sel pada tingkat seluler. Sejumlah perubahan atau kerusakan yang timbul dapat digunakan untuk memprediksi kemungkinan risiko akibat radiasi pada kesehatan tubuh, antara lain kerusakan pada kromosom sel darah putih. Perubahan pada struktur kromosom atau aberasi kromosom merupakan gold standar dari indikator kerusakan pada tubuh akibat pajanan radiasi yang sangat dapat diandalkan untuk digunakan sebagai dosimeter biologi [1]. Aberasi kromosom yang diinduksi oleh radiasi pengion pada sel limfosit dapat berupa aberasi tidak stabil, seperti kromosom disentrik dan kromosom cincin, dan aberasi stabil seperti translokasi. Analisa frekuensi kromosom disentrik khususnya digunakan pada individu yang terpajan secara akut akibat kerja atau dalam kasus kecelakaan radiasi yang harus dilakukan dalam waktu secepatnya pasca paparan radiasi, karena jumlah sel yang mengandung kromosom ini akan terus menurun bersama dengan bertambahnya waktu pasca pajanan radiasi sebagai akibat dari proses seleksi yang terjadi selama proliferasi sel [1,2]. Terhadap individu yang terpajan radiasi secara kronik dalam waktu yang lama dapat dilakukan pemeriksaan aberasi kromosom bersifat stabil yaitu translokasi. Kromosom ini tidak hilang dengan bertambahnya waktu karena sel yang mengandung kromosom bentuk ini tidak mati ketika melakukan pembelahan sel. Dengan demikian adanya translokasi pada kromosom dapat digunakan sebagai indikator kerusakan genetik yang tetap ada pada sel darah pekerja atau individu yang terpapar radiasi setelah waktu yang lama atau sebagai indikator terjadinya akumulasi kerusakan untuk pendugaan risiko timbulnya kerusakan yang mengarah pada pembentukan kanker akibat radiasi. Pemeriksaan ini dapat digunakan untuk memprediksi kemungkinan adanya risiko pembentukan kanker pada individu meskipun terpapar radiasi pada waktu beberapa tahun yang lalu. Translokasi berperan dalam proses perkembangan kelainan atau penyakit genetik dan dalam karsinogenesis termasuk proses aktivasi onkogen yang menyebabkan sel normal berkembang menjadi sel malignan [2,3].
Analisa aberasi kromosom stabil sangat sulit bila menggunakan tehnik pewarnaan (banding) konvensional seperti yang digunakan untuk pengamatan kromosom tidak stabil. Telah dikembangkan suatu tehnik yang lebih praktis untuk memvisualisai terjadinya translokasi atau inversi pada kromosom yang dikenal sebagai Fluorescence in situ hybridization (FISH). Chromosome Painting ini merupakan suatu tehnik pengujian yang dapat digunakan untuk analisa sitogenetik rutin baik untuk deteksi perubahan struktur maupun jumlah kromosom secara individual. Uji ini juga berpotensi untuk dapat digunakan dalam menentukan tingkat radiosensitivitas sel normal atau sel kanker secara in vitro yang hasilnya akan berperanan penting untuk optimasi tehnik radioterapi pada tingkat individual. Dengan demikian FISH ini sangat bermanfaat untuk memprediksi efek radiasi tertunda khususnya kanker melalui analisa kerusakan sitogenetik [4,5]. Pada penelitian sebelumnya telah dikuasai teknik FISH untuk pengamatan aberasi kromosom stabil (translokasi) dengan menggunakan whole kromosom probe tunggal dan telah diaplikasikan pemanfaatannya untuk pemeriksaan pekerja radiasi yang terpajan radiasi berlebih dengan menggunakan wcp berlabel pada kromososm no 1.2. 4 dan 5. Tujuan penelitian ini adalah pengembangan kualitas tehnik FISH dengan menggunakan campuran dua probe kromosom berlabel, sehingga hasil pengecatan kromosom yang mengalami translokasi akan lebih baik. II. TATA KERJA II. 1. Subjek Penelitian Sampel darah diperoleh dari 10 pekerja radiasi laki-laki dengan rentang usia antara 29 59 tahun, masa kerja 13 27 tahun dan bekerja dengan sumber radiasi -. Data setiap pekerja radiasi yang meliputi usia dan masa kerja ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel 1. Data pekerja radiasi sebagai donor sampel darah Nomor pekerja radiasi Umur (tahun) Masa kerja (tahun) Sumber Radiasi 1. 46 13 2. 45 24 3. 52 27 4. 44 24 5. 52 24 6. 49 22 7. 29 22 8. 45 15 9. 31 13 10. 59 17
II.2. Pembiakan dan pemanenan sel darah limfosit Dari setiap pekerja radiasi diambil sekitar 5 ml darah tepi menggunakan syringe dan segera ditambah 0,03 ml heparin sebagai anti koagulan. Sampel darah ini dibiakkan secara duplo. Ke dalam tabung kultur, dimasukkan media pertumbuhan 7,5 ml RPMI-1640, 0,1 ml L- Glutamin, 1 ml Fetal Bovine Serum, 0,2 ml Penicillin Streptomycin, 1 ml darah dan 0,06 ml Phytohaemagglutinin. Tabung kemudian ditutup disimpan dalam inkubator 37 o C selama 72 jam. Pada 3 jam sebelum pemanenan, ke dalam biakan ditambahkan 0,1 ml colchisin untuk menghentikan proses pembelahan untuk memperoleh sel tahap metafase. Darah yang telah dibiakkan, disentrifus dengan kecepatan 1300 rpm selama 10 menit. Pada endapan darah ditambahkan 10 ml KCl 0,56%, diaduk dengan pipet Pasteur dan disimpan pada waterbath 37º C selama 13 menit. Larutan selanjutnya disentrifuse kembali dengan kecepatan yang sama selama 5 menit. Pada endapan ditambahkan 4 ml larutan carnoy (metanol : asam asetat = 3 : 1), divortex, dan kemudian ditambahkan lagi larutan carnoy sampai volume total mencapai 10 ml. Larutan tersebut disentrifus kembali beberapa kali sampai diperoleh endapan sel limfosit yang berwarna putih. II.3. Pembuatan preparat dan pengecatan kromosom dengan teknik FISH Endapan sel limfosit diteteskan di atas gelas preparat pada tiga tempat yang berbeda dan dikeringkan di atas hot plate 65º C selama 1½ jam. Dengan mikroskop, dilakukan seleksi terhadap preparat yang mempunyai sebaran kromosom yang baik pada sel tahap metafase. Preparat tersebut didehidrasi dengan dimasukkan ke dalam seri coplin jar yang berisi etanol 70% sebanyak 2x masing-masing selama 2 menit, etanol 90% 2x selama 2 menit dan etanol 100% sebanyak 1x selama 5 menit. Preparat kemudian dikeringkan di atas hot plate 65ºC selama 1½ jam. Kromosom pada preparat selanjutnya di denaturasi dengan dimasukkan ke dalam larutan formamida dan diinkubasi pada waterbarh 65ºC selama 1½ menit. Preparat dicuci secara berturutan dengan alkohol 70% dingin selama 4 menit, 70% selama 2 menit, 90% sebanyak 2 x masing-masing selama 2 menit dan 100% selama 5 menit. Kromosom pada preparat telah siap untuk dilakukan hibridisasi dengan whole chromosome probe (WCP) nomor 1, 2, 5, 8 dan 10. WCP yang digunakan merupakan produksi ID Labs. USA. Dibuat campuran 1 µl WPC berlabel Fluorescent isothiocyanate (FITC) dengan 4 µl buffer, disentrifus selama 1-3 detik, didenaturasi pada suhu 65º C selama 10 menit, dan kemudian
diinkubasi pada waterbath 37 ºC selama 45 menit. Proses hibridisasi (pengecatan) dilakukan dengan meneteskan larutan probe pada preparat yang telah di denaturasi, kemudian ditutup dengan coverslip dan dilem untuk mencegah terjadi penguapan. Preparat diletakkan dalam wadah plastik dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 16 jam. Setelah proses hibridisasi coverslip dibuka, secara berturutan preparat direndam dalam seri coplin jar yang berisi larutan pencuci stringency 45 ºC sebanyak 2x masing-masing selama 5 menit, larutan 1 x SSC sebanyak 2 x selama 5 menit, dan larutan detergen sebanyak 1x selama 4 menit. Preparat dikeringkan, diteteskan 10 µl 4,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI), ditutup, dan didiamkan selama 10 menit. DAPI yang merupakan counterstain terhadap kromosom yang tidak dihibridisasi dengan WCP, diperoleh dari VYSIS (VX-32804830). Preparat segera diamati dengan mikroskop epifluorescent yang dilengkapi dengan filter biru, dan dilakukan pemotretan terhadap kromosom yang memiliki pendaran probe kromosom. II.4. Pembuatan preparat dan pewarnaan kromosom dengan Giemsa Endapan sel limfosit diteteskan di atas gelas objek pada tiga tempat yang berbeda. Setelah kering, pada preparat diberi pewarnaan Giemsa 4% selama 5 menit. Setelah dicuci dan dikeringkan, preparat ditutup dan siap untuk dilakukan pengamatan dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 kali terhadap jenis aberasi kromosom tak stabil. Penghitungan dilakukan terhadap jumlah kromosom pada setiap sel metafase. Bila kromosom berjumlah 45 atau 47, maka dilakukan penghitungan dan pencatatan jumlah kromosom disentrik, cincin dan atau fragmen/potongan kromosom terhadap 200 1000 sel metafase. III. HASIL DAN PEMBAHASAN Data pemeriksaan untuk aberasi kromosom disentrik, cincin dan fragmen serta pengecatan kromosom ditampilkan pada Tabel 2. Tabel 2. Hasil pemeriksaan aberasi kromosom stabil dan tidak stabil pada 10 pekerja radiasi No Pekerja radiasi MasaKerja (tahun) Aberasi kromosom stabil Aberasi kromosom tidak stabil No. wcp Translokasi Jumlah sel Fragemt Disentrik metafase asentrik 1. 13 1 dan 2-500 - - - 2. 24 1 dan 2-500 - - - 3. 27 2 dan 10-1000 2 5 1 4. 24 2 dan 10-500 - - - 5. 24 1 dan 5-500 - - - 6. 22 1 dan 5-500 - - - 7. 22 1 dan 5-500 - 1 - Cincin
8. 15 4 dan 8-1000 - - - 9. 13 1 dan 8-1000 2-10. 17 2 dan 5-500 - - - Dalam penelitian ini sampel darah diperoleh dari 10 pekerja radiasi yang mempunyai masa kerja bervariasi dengan masa kerja 13-27 th, dengan penerimaan dosis berdasarkan data film badge berkisar antara 0,24 1,23 msv /triwulan. Pemeriksaan terhadap aberasi kromosom dilakukan untuk jenis aberasi kromosom stabil yaitu disentrik, fragmen dan cincin sedangkan aberasi kromosom stabil yaitu translokasi. Hasil pengamatan kromosom tak stabil (disentrik) pada 8 sampel darah pekerja radiasi adalah normal untuk setiap 500 atau 250 sel metafase, sedangkan pada dua sampel pekerja radiasi dijumpai aberasi kromosom tak stabil yaitu disentrik serta cincin dari 1000 metafase sel. Namun hasil tersebut masih dikategorikan dalam kisaran normal. Sedangkan hasil pengamatan kromosom stabil (translokasi) menunjukkan bahwa pada ke 8 sampel darah pekerja radiasi yang berhasil diamati pada sel limfosit dan telah dilakukan pengecatan dengan kromosom no 1,2,4,5,8 dan 10, dengan komposisi probe, 1&2, 2&10, 1&5, 4&8, 1&8, 2&5 pada umumnya tidak ditemukan adanya aberasi kromosom stabil (translokasi), kecuali pada pekerja radiasi dengan kromosom 2&5 dan 4&8 ditemukan adanya indikasi patahan (aberasi kromosom) seperti terlihat pada (d) dan (f) Gambar 1. Perlu pemeriksaan lebih dengan melakukan pengecatan dengan 3 probe berlabel, untuk mengetahui adanya translokasi dengan lebih baik. (a) (b) (c)
(d) (e) (f) Gambar 1. Kromosom dengan probe no 1&2 (a), Kromosom dengan probe no 1 dan 5 (b), Kromosom dengan probe no 1& 8 (c), Kromosom dengan probe 2 &5 (d), Kromosom dengan probe 2 & 10 (e) dan Kromosom denga Probe no 4 &8 (F) Terdapat kemungkinan tidak ditemukan kromosom yang mengalami translokasi karena dosis radiasi yang mengenai kromosom tidak cukup besar untuk dapat menimbulkan patahan. Dosis ambang radiasi secara akut yang dibutuhkan untuk dapat menginduksi aberasi kromosom termasuk translokasi adalah 0,25 Gy. Penguasaan tehnik analisis dengan tehnik FISH masih perlu pengembangan lebih lanjut dengan melakukan pengamatan aberasi kromosom stabil dengan menggunakan 3 probe. IV. KESIMPULAN Dari hasil pengamatan kromosom tak stabil (disentrik) pada 10 pekerja radiasi diperoleh 2 pekerja radiasi dengan aberasi kromosom tak stabil yaitu disentrik dan cincin, namun hasil tersebut masih dalam kisaran normal. Sedangkan hasil pengamatan kromosom stabil (translokasi) menggunakan 2 probe tidak ditemukan adanya aberasi kromosom (translokasi). Telah dikuasai pengecatan kromosom menggunakan 2 whole chromosome probe. Penguasaan analisis dengan teknik FISH yang telah dicapai masih perlu pengembangan lebih lanjut selain untuk memperoleh hasil yang lebih baik juga menggunakan 3-4 whole chromosome probe. DAFTAR PUSTAKA: 1. IAEA. Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment. Technical Reports Series No. 405. IAEA, Vienna. 2001. 2. CIGARRAN, S., BARQUINERO, J.F., BARRIOS, L., RIBAS, M., EGOZCUE, J., And CABALLIN, M.R., Cytogenetic Analyses by Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) in Hospital Workers Occupationally Exposed to Low Levels of Ionizing Radiation. Radiation Research 155, 417-423. 2001. 3. COCO-MARTIN, J.M., SMEET, M.F.M.A., POGGENSEE, M., MOOREN, E., HOFLAND, I., VAN DE BRUG, M., OTTENHEIM, C., BARTELINK, H. and BEGG, A.C. Use of Flourescence In Situ
Hybridization to Measure Chromosome Aberrations as A Predictor of Radiosensitivity in Human Tumour Cells. Int. J. Radiat. Biol. 66 (3). 297-307. 1994. 4. BOTHWELL, A.M., WHITEHOUSE, C.A., and TAWN, E.J. The Application of FISH fro Chromosome Analysis in Relation to Radiation Exposure. Radiation Protection Dosimetry vol. 88 (1), 7-14. 2000. 5. LINDHOLM,C and SALOMAA,S. Dose Assessment of Past Accidental or Chronic Exposure Using FISH Chromosome Painting. Radiation Protection Dosimetry vol. 88 (1), 21-26. 2000. 6. Hall., E.J Radiobiology for the Radiobiologist JB Lippincott mpany, Philadelphia.5 Edition. 2000