DETEKSI KEBERADAAN PENYEBAB PENYAKIT

DETEKSI KEBERADAAN PENYEBAB PENYAKIT Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) SECARA MOLEKULER PADA TANAMAN JERUK SIAM (Citrus nobilis Lour var. microcarpa Hassk) BERDASARKAN VARIASI GEJALA KLOROSIS SKRIPSI Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Fakultas Pertanian Universitas Udayana Oleh Ika Nurhayati NIM. 1205105011 KONSENTRASI PERLINDUNGAN TANAMAN PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016 i

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA SKRIPSI Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka. Saya bersedia dikenakan sanksi sebagaimana diatur dalam aturan yang berlaku apabila terbukti bahwa skripsi ini bukan hasil karya saya sendiri atau mengandung tindakan plagiarism. Demikian pernyataan ini dibuat dengan sebenarnya untuk dapat dipergunakan seperlunya. Denpasar, 09 Juni 2016 Yang menyatakan, Ika Nurhayati NIM. 1205105011 ii

ABSTRAK Ika Nurhayati. NIM 1205105011. Deteksi Keberadaan Penyebab Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) secara Molekuler pada Tanaman Jeruk Siam (Citrus nobilis Lour var. microcarpa Hassk) berdasarkan Variasi Gejala Klorosis. Dibimbing oleh: Ir. Wayan Adiartayasa, M.Si. dan Ir. I Gusti Ngurah Bagus, M.P. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan bakteri Liberobacter asiaticum, penyebab penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration pada tanaman jeruk dengan tingkat gejala klorosis yang berbeda. Penelitian ini telah dilakukan di UPT Laboratorium Sumber Daya Genetika dan Biologi Molekuler Universitas Udayana. Sampel daun yang digunakan dihitung kandungan klorofilnya menggunakan klorofil meter dan selanjutnya diidentifikasi secara molekuler dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer O11 dan O12 yang akan mengamplifikasi fragmen spesifik 16S rdna. Hasil ratarata kandungan klorofil setiap sampel adalah 26,80; 36,52; 36,62; 40,74; 44,56; 47,06; 58,44 dan 65,16 SPAD. Hasil amplifikasi DNA setiap sampel, tidak ditemukan pita DNA 1160 bp pada sampel dengan rata-rata kandungan klorofil 58,44 dan 65,16 SPAD dan pada sampel dengan kandungan klorofil 26,80; 36,52; 36,62; 40,74; 44,56 dan 47,06 SPAD ditemukan pita DNA 1160 bp. Oleh karena pita DNA 1160 bp adalah milik bakteri L. asiaticum, maka sampel bereaksi positif terhadap bakteri L. asiticum dan dapat dipastikan sampel tersebut terinfeksi CVPD, sehingga jumlah kandungan klorofil daun tanaman jeruk 47,06 SPAD dapat digunakan sebagai dasar untuk mendiagnosa penyakit CVPD pada tanaman jeruk. Kata kunci: CVPD, Liberobacter asiaticum, klorosis, PCR iii

ABSTRACT Ika Nurhayati. NIM 1205105011. Detection of the Presence of Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) Disease Causing in Molecular on Citrus (Citrus nobilis Lour var. microcarpa Hassk) which Based on Variation of Chlorosis Symptoms. Supervised by: Ir. Wayan Adiartayasa, M.Si. and Ir. I Gusti Ngurah Bagus, M.P. This research was aimed to identify the presence of Liberobacter asiaticum which caused of Citrus Vein Phloem Degeneration disease on citrus leave with different chlorosis symptoms. This research was conducted at Laboratory of Genetics Resources and Biology Molecular, Udayana University. The leaves sample were measured the chlorophyll content using a chlorophyll meter and then were identified in molecular using Polymerase Chain Reaction (PCR) technique, using primer O11 and O12 which will amplified the specific fragmen of 16S rdna. The result for chlorophyll content indicated that the leaf samples were containing 26.80, 36.52, 36.62, 40.74, 44.56, 47,06, 58.44 and 65.16 SPAD. DNA amplification showed that the leaves which contained chlorophyll at 58.44 and 65.16 SPAD didn t show DNA bands with size 1160 bp, and leaves which contained chlorophyll at 26.80, 36.52, 36.62, 40.74, 44.56 and 47.06 SPAD showed DNA bands 1160 bp. Therefor the DNA bands 1160 bp is expression by L. asiaticum, then the citrus leaf samples were detected positive for the L. asiaticum and the samples were positive infected by CVPD disease, so that the chlorophyll content of citrus leaves at 47.04 SPAD can be used as basis to diagnosis CVPD disease on citrus plants. Keywords: CVPD, Liberobacter asiaticum, Chlorosis, PCR iv

RINGKASAN Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) merupakan salah satu penyakit yang menyerang tanaman jeruk dan dapat menurunkan produksi tanaman jeruk. Penyakit CVPD yang juga disebut citrus greening atau huanglongbin disebabkan oleh bakteri Liberobacter yang tergolong dalam subdivisi Protobacteria. Bakteri Liberobacter hidup dalam floem tanaman jeruk dan menimbulkan gejala yang khas yaitu bergejala klorosis pada daun. Bakteri tersebut belum bisa dibiakkan pada media buatan. Pengamatan di lapangan, tanaman jeruk yang diduga terserang penyakit CVPD memiliki gejala klorosis yang bervariasi. Oleh karena itu perlu dilakukan deteksi keberadaan patogen penyebab penyakit CVPD (bakteri Liberobacter asiaticum) secara molekuler dengan teknik PCR, berdasarkan perbedaaan gejala klorosis dengan klorofil meter (SPAD). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui keberadaan bakteri L. asiaticum pada daun tanaman jeruk pada tingkatan gejala klorosis yang berbeda. Penelitian dilaksanakan dengan mengamati gejala klorosis penyakit CVPD secara visual, pada lahan milik petani di Desa Batukaang Kecamatan Kintamani Kabupaten Bangli, Desa Jungutan Kecamatan Bebandem Kabupaten Karangasem dan Desa Pelaga Kecamatan Petang Kabupaten Badung. Sampel daun yang diambil adalah daun dari tanaman jeruk dengan berbagai umur, yang menunjukkan gejala klorosis dan yang tidak bergejala klorosis sebanyak lima helai. Sampel daun diukur kadar klorofilnya dengan menggunakan klorofil meter. Pengukuran kandungan klorofil dilakukan terhadap lima daun dan setiap daun diukur lima kali sebagai sampel. Sampel yang telah diukur kadar klorofilnya kemudian dideteksi keberadaan bakteri L. asiaticum secara molekuler dengan teknik PCR, yang meliputi tiga tahapan yaitu: isolasi total DNA; amplifikasi DNA; dan visualisai hasil PCR. Berdasarkan hasil pengamatan secara visual terhadap gejala klorosis penyakit CVPD terdapat variasi gejala klorosis pada daun jeruk. Hasil pengukuran kandungan klorofil pada kedelapan sampel daun memiliki rata-rata kandungan klorofil masing-masing 26,80; 36,52; 36,62; 40,74; 44,56; 47,06; 58,44 dan 65,16 SPAD. Hasil isolasi total DNA beberapa daun tanaman jeruk pada elektroforesis gel agarose 1%, didapatkan adanya pita total DNA pada kolom b (44,56 SPAD), c v

(40,74 SPAD), e (36,52 SPAD), f (47,06 SPAD) dan g (26,80 SPAD), dan pada kolom tersebut masih ditemukan RNA yang tampak semir. Sedangkan pita total DNA tampak kurang jelas pada kolom a (58,44 SPAD), d (65,15 SPAD) dan h (36,62 SPAD) Hasil visualisi DNA amplifikasi pada gel agarose 1% menunjukkan pada sampel dengan rata-rata kandungan klorofil 58,44 dan 65,16 SPAD tidak ditemukan pita DNA 1160 bp, sedangkan pada sampel dengan kandungan klorofil 26,80; 36,52; 36,62; 40,74; 44,56 dan 47,06 SPAD ditemukan pita DNA 1160 bp. Oleh karena bakteri L. asiaticum memiliki pita DNA 1160 bp, maka sampel berekasi positif terhadap bakteri L. asiticum, sehingga jumlah kandungan klorofil daun tanaman jeruk 47,06 SPAD dapat digunakan sebagai dasar untuk mendiagnosa penyakit CVPD pada tanaman jeruk. vi

DETEKSI KEBERADAAN PENYEBAB PENYAKIT Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) SECARA MOLEKULER PADA TANAMAN JERUK SIAM (Citrus nobilis Lour var. microcarpa Hassk) BERDASARKAN VARIASI GEJALA KLOROSIS IKA NURHAYATI NIM. 1205105011 Menyetujui, Pembimbing I Pembimbing II Ir. Wayan Adiartayasa, M.Si. Ir. I Gusti Ngurah Bagus, M.P. NIP 19560703 198601 1 001 NIP. 19571111 198603 1 001 Mengesahkan, Dekan Fakultas Pertanian Universitas Udayana Tanggal Lulus: 09 Juni 2016 Prof. Dr. Ir. I Nyoman Rai, M.S. NIP. 19630515 1988 1 001 vii

DETEKSI KEBERADAAN PENYEBAB PENYAKIT Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) SECARA MOLEKULER PADA TANAMAN JERUK SIAM (Citrus nobilis Lour var. microcarpa Hassk) BERDASARKAN VARIASI GEJALA KLOROSIS dipersiapkan dan diajukan oleh Ika Nurhayati NIM. 1205105011 telah diuji dan dinilai oleh Tim Penguji pada tanggal 09 Juni 2016 Berdasarkan SK Dekan Fakultas Pertanian Universitas Udayana No : 106/UN14.1.23/DL/2016 Tanggal : 07 Juni 2016 Tim Penguji Skripsi adalah: Ketua : Prof. Dr. Ir. I Gede Putu Wirawan, M.Sc. Anggota : 1. Prof. Dr. Ir. I Nyoman Wijaya, M.S. 2. Dr. Ir. I Ketut Suada, M.P. 3. Ir. I Gusti Ngurah Bagus, M.P. 4. Ir. Wayan Adiartayasa, M.Si. viii

RIWAYAT HIDUP Ika Nurhayati lahir di Desa Ganting Wetan, Kecamatan Maron, Kabupaten Probolinggo Jawa Timur, pada tanggal 08 Maret 1994. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Ahmad Fauzi dan Kristin Indawati. Penulis mengawali pendidikan di TK Dharma Wanita Desa Ganting Wetan pada tahun 1998-2000, kemudian melanjutkan kesekolah dasar SD Negeri Ganting Wetan Kecamatan Maron, Kabupaten Probolinggo pada tahun 2000-2006, pendidikan menengah pertama SMP Negeri 3 Maron Probolinggo pada tahun 2006-2009, pendidikan menengah atas SMA Negeri 1 Kraksaan Probolinggo pada tahun 2009-2012. Sejak Agustus 2012, melalui jalur SNMPTN Undangan, penulis diterima sebagai mahasiswa pada Program Studi Agroekoteknologi, Konsentrasi Perlindungan Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Udayana, dan penulis merupakan penerima Beasiswa Bidikmisi. Selama menjadi mahasiswa penulis aktif dalam berbagai kegiatan kemahasiswaan, diantaranya Fungsionaris Dewan Perwakilan Mahasiswa Universitas Udayana periode 2013/ 2014, Fungsionaris Badan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Pertanian Universitas Udayana periode 2013/ 2014, dan Fungsionaris Himpunan Mahasiswa Agroekoteknologi (HIMAGROTEK) Fakultas Pertanian Universitas Udayana periode 2013/ 2014 dan periode 2014/ 2015. Penulis juga aktif di kepanitiaan pada kegiatan kemahasiswaan di tingkat jurusan Agroekoteknologi maupun di tingkat Fakultas Pertanian Universitas Udayana. ix

KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena berkat rahmat, karunia dan nikmat-nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Skripsi ini disusun berdasarkan penelitian yang berjudul Deteksi Keberadaan Penyebab Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) Secara Molekuler Pada Tanaman Jeruk Siam (Citrus nobilis Lour var. microcarpa Hassk) Berdasarkan Variasi Gejala Klorosis. Skripsi ini penulis ajukan sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Pertanian pada Fakultas Pertanian Universitas Udayana, Denpasar. Pada kesempatan kali ini penulis mengucapkan terima kasih kepada pihak yang terhormat: 1. Presiden Republik Indonesia melalui Menteri Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi yang telah memberikan Beasiswa Bidikmisi kepada penulis. 2. Dekan Fakultas Pertanian Universitas Udayana yang telah memberikan berbagai fasilitas kepada penulis seama menjadi mahasiswa. 3. Ketua Program Studi Agroekoteknolgi Fakultas Pertanian Universitas Udayana yang telah memberikan fasilitas, perhatian, bimbingan dan semangat selama penulis menjadi mahasiswa. 4. Ketua, sekretaris dan staf UPT Laboratorium Sumber Daya Genetika dan Biologi Molekuler yang telah memberikan fasilitas kepada penulis selama melakukan penelitian. 5. Ir. Wayan Adiartayasa, M.Si., selaku dosen Pembimbing I yang telah mendampingi dan membimbing dengan sabar, memberi semangat serta masukan dan saran kepada penulis selama penelitian dan penulisan skripsi ini. 6. Ir. I Gusti Ngurah Bagus, M.P., selaku pembimbing II yang telah meluangkan waktu untuk memberikan masukan-masukan serta motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. 7. Prof. Dr. Ir. I Gede Putu Wirawan, M.Sc., Prof. Dr. Ir. I Nyoman Wijaya, M.S. dan Dr. I Ketut Suada, M.P., selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan dalam penulisan skripsi ini. x

8. Ir. I Nyoman Sutedja, M.S., selaku pembimbing akademik yang banyak memberikan dukungan, saran dan pendapat selama penulis menjadi mahasiswa. 9. Kedua orang tua tercinta, Bapak Ahmad Fauzi dan Ibu Kristin Indawati, kedua adik saya, M. Faizul Muttaqin dan M. Naufal Tri Pamungkas serta keluarga besar, yang telah memberi kasih sayang, dukungan serta doa yang tak henti-hentinya, sehingga studi penulis dapat terselesaikan dengan baik. 10. Rekan penelitian, TIM CVPD (Vani Silvana, S.P., Octa Fransisca Sitorus, S.P. dan I Kadek Purnawirawan Putra, S.P.), Sahabat Bodat (Ananda, Adinda, Irnawati, Domi, Maya dan Dharma), Ibu Diah Yuniti, Beni, Najib dan Rijal atas kerjasama dan dukungannya sehingga penulis dapat sampai pada tahap ini. 11. Rekan-rekan Agroekoteknologi 2012, khusunya Konsentrasi Perlindungan Tanaman, teman-teman KKN-PPM Unud XI Desa Bunutin, serta teman-teman kost yang memberikan motivasi kepada penulis selama tahap penelitian sampai skripsi ini terselesaikan. 12. Serta semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa skripsi penelitian ini masih jauh dari sempurna, sehingga penulis sangat mengharapkan saran dan petunjuk yang mengarah pada penyempurnaan skripsi penelitian ini. Selanjutnya besar harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi akademisi maupun khalayak umum. Denpasar, 09 Juni 2016 Penulis xi

DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... i PERNYATAAN KEASLIAN KARYA SKRIPSI... ii ABSTRAK... iii ABSTRACT... iv RINGKASAN... v HALAMAN PERSETUJUAN... vii TIM PENGUJI... viii RIWAYAT HIDUP... ix KATA PENGANTAR... x DAFTAR ISI... xii DAFTAR TABEL... xiv DAFTAR GAMBAR... xv DAFTAR LAMPIRAN... xvi I. PENDAHULUAN... 1 1.1 Latar Belakang... 1 1.2 Rumusan Masalah... 3 1.3 Tujuan Penelitian... 3 1.4 Manfaat Penelitian... 4 1.5 Hipotesis... 4 II. TINJAUAN PUSTAKA... 5 2.1 Tanaman Jeruk... 5 2.1.1 Jeruk Siam... 6 2.2 Klorofil Tanaman... 6 2.3 Penyakit CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration)... 8 2.3.1 Gejala Penyakit CVPD... 9 2.3.2 Penyebab Penyakit CVPD... 10 2.4 Penyebaran Bakteri Penyakit CVPD... 12 2.5 Serangga Vektor Penyakit CVPD... 12 2.6 Teknik PCR... 15 III. METODE PENELITIAN... 18 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian... 18 3.2 Bahan dan Alat... 18 3.3 Pelaksanaan penelitian... 18 3.4 Deteksi Keberadaan Bakteri Penyebab Penyakit CVPD secara Molekuler... 19 3.5 Variabel Penelitian... 21 xii

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN... 22 4.1 Gejala Penyakit CVPD... 22 4.2 Isolasi Total DNA pada Daun Tanaman Jeruk... 25 4.3 Amplifikasi Total DNA dengan Teknik PCR... 26 V. KESIMPULAN DAN SARAN... 28 5.1 Kesimpulan... 28 5.2 Saran... 28 DAFTAR PUSTAKA... 29 LAMPIRAN... 34 xiii

DAFTAR TABEL Nomor Teks Halaman 4.1 Rata- rata Kandungan Klorofil Daun Tanaman Jeruk yang Bergejala Klorosis dan yang Tidak Bergejala Klorosis... 24 xiv

DAFTAR GAMBAR Nomor Teks Halaman 2.1 Gejala Khas Penyakit CVPD (Klorosis)... 9 2.2 Buah jeruk yang terinfeksi CVPD mengalami red nose... 10 2.3 Bakteri Liberobacter... 11 2.4 Nimfa dan imago Diaphorina citri Kuwayama... 14 4.1 Variasi Gejala Klorosis pada Daun Jeruk Siam... 23 4.2 Hasil Eletroforesis Total DNA Daun Tanaman Jeruk pada Gel Agarose 1%... 26 4.3 Hasil Elektroforesis DNA Teramplifikasi pada Gel Agarose 1%... 27 xv

DAFTAR LAMPIRAN Nomor Teks Halaman 1. Kandungan Klorofil Kandungan Klorofil Daun Tanaman Jeruk yang Bergejala Klorosis dan yang Tidak Bergejala Klorosis... 34 xvi