BAB II Tinjauan Pustaka Pada bab ini dipaparkan penjelasan singkat mengenai beberapa hal yang berkaitan dengan penelitian ini, yaitu mengenai DNA mitokondria manusia, basis data GenBank, basis data MITOMAP, serta program Human mtdna Analyzer. II.1 DNA Mitokondria (mtdna) Mitokondria adalah organel subseluler yang ditemukan pada sitoplasma sel eukariot dan bertugas untuk memproduksi energi bagi sel melalui pembentukan senyawa adenosin triposfat (ATP). Salah satu keistimewaan dari organel ini yaitu mempunyai sistem genetik sendiri dengan semua materi pendukung untuk mengekspresikan informasi genetik yang dikandungnya. Asam deoksiribonukleat mitokondria manusia (mtdna) adalah molekul penyimpan informasi genetik berbentuk sirkular dengan panjang 16.569 pasang basa yang mengkode 37 buah gen: dua asam ribonukleat ribosom (rrna), komponen spesifik ribosom mitokondria, 22 RNA transfer (trna), berfungsi untuk menerjemahkan kode genetik mitokondria, dan 13 polipeptida yang merupakan subunit dari komplek protein pada sistem fosforilasi oksidatif, yaitu tahap terakhir jalur pembentukan ATP. Peta informasi genetik mtdna manusia tersebut ditunjukkan pada Gambar II.1. Jumlah kopi mtdna pada setiap sel bervariasi, dari hanya berjumlah beberapa ratus pada sel sperma sampai dengan 100.000 kopi mtdna pada sel oocyte, sel bakal ovum. Perbedaan jumlah kopi mtdna yang demikian besar yang menjadi penyebab mengapa mtdna diturunkan kepada anak hanya dari pihak ibu, meskipun sel sperma pada akhirnya bergabung dengan sel oocyte pada proses reproduksi. Sebagian besar sel mitokondria berada pada bagian ekor sel sperma, dan bagian ekor ini akan hilang pada proses fertilisasi, sedangkan mitokondria yang berhasil menembus ovum akan dieliminasi pada tahap awal embriogenesis (Manfredi et al., 1997).
5 Gambar II.1 Peta genetik DNA mitokondria manusia (mtdna) mtdna berbentuk sirkular dengan panjang 16.569 pasang basa yang mengkode 37 buah gen: dua asam ribonukleat ribosom (rrna), 22 transfer RNA (trna), dan 13 polipeptida. Berbeda dengan DNA inti dimana terjadi proses rekombinasi antara gen yang berasal dari ayah dan ibu, proses rekombinasi mtdna berlangsung antar kopi dirinya sendiri pada mitokondria yang sama. Fakta bahwa mtdna diturunkan hanya dari pihak ibu inilah yang mendasari peran mtdna sebagai sumber identifikasi forensik dan penyusuran garis keturunan. Studi menunjukkan bahwa mtdna mengalami mutasi spontan 10 kali lebih tinggi dibandingkan yang terjadi pada DNA inti. Mutasi dengan kecepatan tinggi ini kemungkinan disebabkan karena interaksi dengan senyawa-senyawa radikal bebas yang terus menerus diproduksi pada mitokondria sebagai konsekuensi tahap akhir oksidasi senyawa karbon pada proses fosforilasi oksidatif. Tingginya kadar senyawa radikal bebas tersebut dapat merusak untai DNA mitokondria yang tidak dilindungi oleh protein histon. Berdasarkan fakta ini, tidaklah mengherankan jika variasi nukleotida pada mtdna antar individu pada spesies yang sama ternyata sangat tinggi (Wallace, 1992).
6 Apabila di dalam satu sel mitokondria terdapat dua jenis populasi mtdna, yaitu normal dan mutan (heteroplasmi), maka setelah berlangsung pembelahan sel dapat dihasilkan tiga macam genotifik yaitu mtdna normal (homoplasmi), mtdna mutan (homoplasmi), atau terdapat mtdna normal dan mtdna mutan (heteroplasmi). Oleh karena itu, fenotifik sel akan bergantung persentase jumlah mtdna mutan yang dikandung. Apabila jumlah molekul DNA relatif rendah maka akan terjadi komplementasi dengan DNA normal, sehingga cacat genetik dapat dihindari. Sebaliknya apabila DNA mutan kadarnya jauh lebih banyak, maka jenis mtdna mutan ini yang akan terus diproduksi di dalam mitokondria selama hidup. Apabila mutasi ini menimbulkan cacat pada protein yang dikode oleh mtdna, maka dapat menyebabkan ATP yang diproduksi menjadi di bawah kadar minimum yang diperlukan oleh tubuh sehingga memicu munculnya penyakit. Mitokondria yang mewarisi heteroplasmi mtdna mutan dapat berakibat sangat mematikan, bahkan sebelum individu baru sempat dilahirkan. Walaupun tingkat mutasi pada mtdna sangat tinggi dan posisi mutasi spesifik sangat banyak ditemukan, tetapi pada umumnya mutasi-mutasi tersebut bersifat silent mutations, atau mutasi yang tidak menimbulkan perubahan fungsi fisiologis pada tubuh. Meskipun demikian, ditemukan sejumlah posisi mutasi pada gen pengkode trna, rrna, dan protein yang diduga kuat memiliki peranan dalam timbulnya penyakit pada manusia. Sejak pertama kali ditemukannya penyakit yang disebabkan oleh kerusakan mtdna (Holt et.al, 1988), telah dilaporkan lebih dari 150 posisi mutasi yang berhubungan dengan penyakit pada manusia. Diantaranya adalah penyakit MERFF yang disebabkan sebuah mutasi pada trna Lys (Noer et al., 1991), mutasi mtdna yang berhubungan dengan tumor (Fliss et al., 2000), serta mutasi pada gen 12S rrna mtdna yang mempengaruhi struktur sekunder RNA dan menyebabkan gangguan pendengaran (Ballana et al., 2006). Posisi-posisi mutasi ini ditemukan berdasarkan keseragaman jenis dan posisi mutasi pada pasien penderita penyakit tertentu terhadap urutan standar nukleotida mtdna manusia, Cambridge Reference Sequence (CRS). CRS adalah data mtdna manusia
7 pertama yang berhasil ditentukan urutan lengkap basa nukleotidanya (Anderson et al., 1981), dan sejak saat itu CRS digunakan sebagai standar urutan nukleotida mtdna manusia. Sepuluh tahun setelah ditemukannya CRS, dilakukan penelitian untuk membangun suatu basis data referensi mtdna manusia menggunakan 13 buah sampel (Marzuki, et al., 1991). Pada penelitian ini berhasil ditemukan 128 variasi nukleotida terhadap CRS pada urutan nukleotida daerah pengkode mtdna dan lima posisi basa nukleotida diantaranya ternyata CRS tergolong mutan dibandingkan sampel mtdna lainnya, ditunjukkan pada Tabel II.1. Dengan kata lain pada lima posisi tersebut variasi nukleotida pada CRS merupakan bentuk perubahan yang minor dibandingkan mtdna manusia lainnya. Fenomena ini merupakan informasi baru mengenai urutan konsensus mtdna manusia. Urutan konsensus ini disusun berdasarkan urutan nukleotida yang paling umum ditemukan pada genom mitokondria manusia. Urutan konsensus ini kemudian diusulkan sebagai referensi standar mtdna manusia. Tabel II.1 Variasi nukleotida mtdna manusia (Marzuki, et al., 1991). Ditemukan 5 posisi nukleotida yang merupakan urutan konsensus mtdna manusia. No. Variasi nukleotida terhadap CRS Persentase terhadap 13 buah sampel 1 G4985A 92% 2 A1438G 85% 3 A8860G 73% 4 A4769G 67% 5 A15326G 60%
8 II.2 Basis data GenBank Pada situs publik National Center for Biotechnology Information (NCBI) terdapat fasilitas basis data yang memuat kumpulan informasi urutan DNA dari seluruh spesies di dunia sejak tahun 1992, yang disebut sebagai basis data GenBank. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html). Salah satu data informasi genetik yang terdapat pada basis data ini adalah informasi urutan lengkap nukleotida mtdna manusia. Setiap data mtdna manusia pada basis data GenBank menyimpan informasi mengenai kode akses sampel, panjang pasang basa, nama penulis serta judul publikasi sampel mtdna tersebut, serta urutan lengkap 16,5 kb basa nukleotida mtdna tiap sampel tersebut, seperti yang ditunjukkan pada Gambar II.2. Gambar II.2 Contoh data urutan lengkap mtdna pada basis data GenBank Setiap data mtdna manusia pada basis data GenBank menyimpan informasi mengenai kode akses sampel, panjang basa, nama penulis serta judul publikasi sampel tersebut, serta urutan lengkap 16,5 kb nukleotida. Informasi urutan lengkap mtdna ini yang digunakan sebagai sumber data penelitian untuk kemudian ditentukan variasi nukleotidanya terhadap urutan standar mtdna manusia, CRS. Data mentah urutan nukleotida mtdna manusia pada basis data GenBank ini dapat diolah untuk keperluan penyusunan basis data variasi nukleotida.
9 II.3 Basis data MITOMAP Basis data MITOMAP (http://www.mitomap.org) khusus menyimpan kumpulan informasi dan hasil penelitian mengenai genom mitokondria manusia. Informasi tersebut diantaranya mengenai fragmen mtdna dan fungsi genetiknya, variasi nukleotida pada mtdna manusia, serta mutasi pada mtdna yang menyebabkan penyakit. Contoh tampilan basis data MITOMAP ditunjukkan pada Gambar II.3. Gambar II.3 Contoh basis data MITOMAP Basis data MITOMAP merupakan kumpulan hasil penelitian mengenai mtdna manusia. Meskipun basis data MITOMAP secara regular terus menerus diperbaharui sesuai dengan publikasi terbaru mengenai mtdna manusia, tetapi belum tersusun format kumpulan basis data variasi nukleotida yang spesifik pada tiap sampel mtdna manusia terhadap CRS sebagaimana basis data yang telah disusun pada penelitian sebelumnya. (Marzuki et al., 1991).
10 II.4 Program Human mtdna Analyzer (H-Man) Program H-Man merupakan hasil pengembangan dari program penentuan variasi nukleotida sebelumnya, Mito Mutation Analyzer, sehingga menjadi lebih mudah untuk digunakan. Di antara kelebihan program H-Man adalah tersedianya fitur pembukaan serta penyimpanan file dan pencarian mutasi pada rentang yang fleksibel (Nurchaedi,. 2007). Pada Gambar II.4 ditampilkan contoh analisa variasi nukleotida mtdna manusia terhadap CRS menggunakan program Human mtdna Analyzer (H-Man) versi 1.2. Gambar II..4 Analisa program Human mtdna Analyzer (H-Man) versi 1.2 Pada program ini ditunjukkan informasi nama sampel dan panjang basanya. Tersedia juga pilihan format menyimpan data dan tipe penjajaran dengan CRS. Kolom terakhir menunjukkan variasi nukleotida terhadap CRS. Program ini dalam waktu singkat memberikan informasi mengenai posisi mutasi substitusi, insersi, dan delesi, serta total jumah variasi nukleotida pada sampel mtdna yang dibandingkan terhadap CRS.