PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DEBBIE S. RETNONINGRUM SEKOLAH FARMASI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1
PUSTAKA 1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110 2. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical Biotechnology, hal. 44-55 3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis, hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme berbeda: fenomena umum di alam. Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus β menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap gejala difteri. Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam alam. Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Duplikasi fenomena alam di laboratorium Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi genetik ke dalam suatu organisme. Manipulasi genetik E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri) Saccharomyces cerevisiae (ragi) Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara tradisional. Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 4
CONTOH PRODUK REKOMBINAN ANTIBODI REKOMBINAN PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktor nekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin manusia VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria VAKSIN DNA TERAPI GEN Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 5
CONTOH PRODUK REKOMBINAN PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit, resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak, penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 6
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID) LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR (= VEKTOR REKOMBINAN) TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG & PERBANYAKAN DNA SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR REKOMBINAN DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA) 1972 Stanley Cohen dan Herbert Boyer Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 7
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) DNA kromosom DNA plasmid Potong dengan enzim restriksi ligasi DNA rekombinan transforman klon transformasi sel 1 sel tumbuh jadi 1 koloni Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 8
Kloning DNA ke Plasmid Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 9
SUMBER DNA SISIPAN TIGA PENDEKATAN: KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA GENOMIK PRODUK PCR mrna cdna (eukariot) Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 10
Kepustakaan genomik (genomic library) Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup semua gen dari suatu organisme Contoh ukuran genom: Bacillus anthracis: 5,1 5,2 Megabasa Escherichia coli: 4 Megabasa Pseudomonas putida: 6,0 6,1 Megabasa Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 11
KROMOSOM vs PLASMID Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 12
PLASMID DNA UNTAI GANDA BERBENTUK LINGKARAN BERSALINAN TINGGI BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI) DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN) ADA DUA GEN MARKER: UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 13
VEKTOR (Plasmid) VEKTOR KLONING HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA VEKTOR EKSPRESI UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahan komponen untuk mempermudah proses downstream /pemurnian) Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 14
Beberapa contoh vektor kloning Nama Tipe Sel inang Keterangan pbr322 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin. Vektor untuk tujuan umum puc8 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Vektor untuk tujuan umum pbluescript Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. λgt10 Bakteriofaga E. coli Kloning cdna YEp24 Plasmid E. coli/ragi Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 15
PETA PLASMID Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 16
ENZIM RESTRIKSI MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA REKOMBINAN MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE MENGENALI URUTAN PALINDROM 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 17
ENZIM RESTRIKSI & LIGASE DNA (enzim restriksi) 5 - NNNGAATTCNNN -3 3 - NNNCTTAAGNNN -5 EcoRI 5 - NNNG OH P AATTCNNN -3 3 - NNNCTTAA P OH GNNN -5 DNA (ligase) 5 - NNNG OH P AATTCNNN -3 3 - NNNCTTAA P OH GNNN -5 ligase 5 - NNNGAATTCNNN -3 3 - NNNCTTAAGNNN -5 Sisi pengenalan enzim restriksi Urutan nukleotida rantai atas = Urutan nukleotida rantai bawah Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 18
CONTOH ENZIM RESTRIKSI EcoRI (Escherichia coli galur R): G AATTC (ujung lancip) BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): G GATCC (ujung lancip) BglII (Bacillus globigii): A GATCT (ujung lancip) SalI (Streptomyces albus): G TCGAC (ujung lancip) PstI (Providencia stuartii 164): CTGCA G (ujung lancip) HindIII (Haemophilus influenzae): A AGCTT (ujung lancip) KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTAC C (ujung lancip) XbaI (Xanthomonas bradii): T CTAGA (ujung lancip) HaeIII (Hemophilus aegyptius): GG CC (ujung tumpul) Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 19
Kloning Produk PCR PCR Ligasi S. pyogenes M12 Gen ska pgemt rekombinan SDM Transformasi E. coli XL-Blue pgemt/ska Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 20
LIGASI PRODUK PCR KE pgem-t A A + ligasi Transformasi Gen ska pgem-t pgem-t REKOMBINAN E. coli JM109 Streptococcus pyogenes Kontrol LB/Amp Kontrol + LB/Amp E. coli pgem-t REK LB/Amp/X-Gal/IPTG Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 21
Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 22
Transformasi info genetik ditransfer ke sel inang dengan metode transformasi Sel inang dibuat kompeten (siap menerima DNA asing ) modifikasi struktur dinding sel Metode transformasi : heat shock/elektroporasi Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 23
Seleksi Transforman Sel kompeten Transformasi Seleksi Biru-Putih Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 24
SELEKSI BIRU PUTIH MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA? PADA MCS TERDAPAT GEN lacz (MENGKODE GALAKTOSIDASE) X-GAL BIRU DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacz GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI X-GAL TIDAK DIURAIKAN PUTIH Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 25
Deteksi keberadaan DNA sisipan Analisis migrasi Analisis restriksi Elektroforesis gel PCR Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing) Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 26
ELEKTROFORESIS GEL Gel agarosa atau poliakrilamid DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat): bergerak dari kutub negatif ke kutub positif DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya: migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar Visualisasi: etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi dengan pemaparan UV) Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 27
Elektroforesis Gel Agarosa Joe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNA Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 28
KONFIRMASI pgem-t T REKOMBINAN Isolasi pgem-t/ska (kit Qiaprep, Qiagene) 1 2 Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan < ukuran plasmid dengan DNA sisipan 1 = pgem-t rekombinan 2 = pgem-t tanpa DNA sisipan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 29
KONFIRMASI pgem-t T REKOMBINAN Isolasi Plasmid Rekombinan 1 2 3 Analisis Restriksi pgem-t rekombinan 1 2 Koloni Biru Koloni Putih Koloni Biru 1419 pb 517 pb pgem-t (3000 bp) 881 pb DNA sisipan Elektrogram hasil isolasi plasmid koloni biru dan putih : 1. Koloni biru 2. Koloni putih 3. Koloni biru Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI 1. Marka puc19/hinfi 2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 30
HASIL PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA DNA SISIPAN (DNA Sequencing) Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 31
HASIL SEKUENSING Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal (Analisis homologi/kesamaan program BLAST dari NCBI) Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 32