LAMPIRAN. Lampiran 1. Daftar Singkatan

Lampiran 1. Daftar Singkatan LAMPIRAN camp : COX : DAB : EGF : GM : HE : HK ATP : HP : HS : IHK : IL 1β : K : LR : M : MS : NM : NO : NOS : OAINS : PA : PAS : PG : PG : PG1 : PG2 : PgE2 : PgI2 : PLN : PLP : Cyclic Adenosine Mono Phosphate Cyclooxygenase 3,3'-diaminobenzidine Epidermal Growth Factor Glandular Mucosa Hematoxylin Eosin Hydrogen Kalium Adenosine Tri Phosphate Histopatologi Human Stomach Imunohistokimia Interleukin 1beta Limiting Ridge Mucosa Mouse Stomach Non Glandular Mucosa Nitric Oxyde Nitric Oxyde Sinthase Obat Anti Inflamasi Non Steroid Patologi Anatomi Periodic Acid Schiff Prostaglandin Pepsinogen Pepsinogen 1 Pepsinogen 2 Prostaglandin E2 Prostaglandin I2 Perlakuan Lesi Negatif Perlakuan Lesi Positif

S : Serosa SM : Sub Mukosa TGF α : Transforming Growth Factor alpha VIP : Vasoactive Intestinal Peptide

Lampiran 2. Komposisi pakan tikus No. Bahan Persentase 1 Jagung 73,943 2 Bungkil 14,505 3 Dedak 6,8 4 Kapur 1,5 5 Tepung tulang 1,263 6 Minyak 1,0 7 Methionin 0,362 8 Lisin 0,31 9 Garam 0,213 10 Vitamin + mineral mix 0,106

Lampiran 3. Data Pakan Tikus Per- Hari

Lampiran 4. Metode Pewarnaan Alcian Blue-Periodic Acid Schiff Metode Pewarnaan Alcian Blue-Periodic Acid Schiff : 1. Perendaman gelas objek dalam xylol I selama 2 menit (deparafinasi). 2. Perendaman dalam xylol II selama 2 menit (deparafinasi). 3. Pembilasan dengan air mengalir. 4. Pembilasan dengan aquades. 5. Perendaman dengan larutan asam asetat glacial (CH 3 COOH) 3% selama 3-5menit. 6. Perendaman dalam pewarna 1% Alcian Blue 8 GX dalam 3% CH 3 COOH (ph 2,5) selama 15-30 menit. 7. Pembilasan dengan larutan asam asetat glacial (CH 3 COOH) 3% selama 1-5 menit. 8. Pembilasan dengan air mengalir. 9. Pembilasan dengan aquades. 10. Pembilasan dengan air mengalir. 11. Perendaman dalam asam asetat 1% selama 5 menit. 12. Pembilasan dengan aquades. 13. Tahap oksidasi kedalam Periodic Acid 1% selama 5-10menit. 14. Pencucian dengan aquades sebanyak 3 kali, dalam waktu 5 menit untuk satu kali pembilasan. 15. Masukkan kedalam Schiff reagen. 16. Pembilasan dengan air sulfite sebanyak 3 kali dengan campuran larutan: a. 10% Sodium Bisulfite (NaHSO 3 ) sebanyak 10ml. b. 1 N HCl sebanyak 10ml. c. Aquadestilata sebanyak 200 ml. ATAU a. 10% Sodium Bisulfite (NaHSO 3 ) sebanyak 18ml.

b. 1 N HCl sebanyak 15ml. c. Aquadestilata sebanyak 300 ml. d. Hematoxyllin Mayer 30 detik. 17. Pembilasan dengan air mengalir selama 10-15 menit. 18. Pembilasan dengan aquades. 19. Perendaman dalam alkohol 95% selama 10 detik. 20. Perendaman dalam alkohol absolut I selama 1 menit. 21. Pencelupan dalam alkohol absolut II selama 2 menit. 22. Pencelupan dalam xylol I selama 1 menit. 23. Pencelupan dalam xylol II selama 2 menit. 24. Setelah proses pewarnaan selesai, kemudian preparat ditutup dengan cover glass dan diberi label. 25. Hasil: Ab (+) berwarna biru, PAS(+) berwarna merah magenta. Pewarnaan ini bertujuan untuk melihat struktur organ/sampel, sel mukus dan jenis-jenis sel radang yang hanya jelas terlihat dengan pewarnaan AB-PAS.

Lampiran 5. Metode Pewarnaan Hematoxylin-Eosin Metode Pewarnaan Hematoxylin-Eosin WAKTU TAHAPAN 1. Xylol I 2 Deparafinisasi 2. Xylol II 3. Alkohol Absolut 4. Alkohol 95% 5. Alkohol 80% 6. Cuci dalam air keran 7. Mayer s Hematoksilin 8. Cuci dalam air keran 9. Lithin Karbonat 10. Cuci dalam air keran 11. Eosin 12. Cuci dalam air ketan 13. Alkohol 95% 14. Alkohol absolut I 15. Alkohol absolute II 16. Xylol I 17. Xylol II 18. Tutup dengan cover glass 2 2 2 1 1 8 30 15-30 2 2-3 2 10x celupan 10x celupan 2 1 2 Rehidrasi Dehidrasi Clearing

Lampiran 6. Metode pewarnaan imunohistokimia isoenzim COX-1 dan COX-2 Prosedur pembuatan pulasan immunohistokimia 1. Sediaan dipotong dengan microtome setebal 4 s/d 5 micron 2. Tempelkan pada gelas objek yang telah di coating 3. Panaskan pada hotplate,lalu simpan didalam incubator bersuhu 38-40c semalam 4. Deparafinisasi dengan xylol sebanyak 3kali masing-masing 5 menit 5. Celupkan kedalam ethanol sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit 6. Celupkan dalam alcohol 90%,80% dan70% masing-masing 5 menit 7. Cuci dengan air mengalir 8. Masukkan kedalam H2O2 dalam methanol dingin 15 menit 9. Cuci dengan aquadest selama 5 menit 10. Rendam dalam cairan buffer citrate,lalu panaskan didalam microwave 2 kali 5 menit 11. Dinginkan pada suhu ruangan selama 20-30 menit 12. Cuci dengan aquadest 13. Beri pembatas pada sekeliling sediaan dengnan Pap pen 14. Cuci dengan PBS 5 menit 15. Teteskan blocking serum lalu incubasi selama 5-10 menit 16. Cuci dengan PBS(baca protocol pabrikan) 17. Buang sisa pencuci,teteskan primary antibody lalu incubasi selama 60 menit 18. Cuci dengan PBS 2kali masing-masing 5 menit 19. Teteskan secondary antibody, incubasi selama 10-20 menit 20. Cuci dengan PBS 2kali masing-masing 5 menit 21. Teteskan HRP-streptavidin biotin,incubasi selama 10-20 menit 22. Cuci dengan PBS 2kali masing-masing 5 menit 23. Teteskan larutan kromogen DAB,incubasi 5-10 menit 24. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit 25. Counterstain dengan mayer haematoxylin,incubasi selama 2 menit 26. Cuci dengan air mengalir selama 5-15 menit 27. Dehiddrasi dengan alcohol 70% sampai dengan xylol masing-masing 5 menit 28. Teteskan entelan lalu tutup dengan cover glass.

Mayers Hamatoxylin Hamatoxylin 0,1 gr Tawas. 5 gr Natriumjodat.. 0,01 gr Aquadest 100 ml Campurkan sampai larut,diamkan semalam. Keesokan harinya tambahkan Chloral hydrat 5 gr Citric acid.. 0,1 gr Campurkan kembali sampai larut, lalu didihkan selama 5 menit. Eosin phloxin 1% Eosin 1% Eosin.. 1gr Aquadest 20 ml Alkohol 96%. 80 ml Phloxin 1% Phloxin.. 1 gr Aquadest... 20 ml Alkohol. 80 ml Eosin 1%... 90 ml Phloxin 1%... 9ml Ethanol.. 715ml Asam acetat. 3,5ml Prosedur pembuatan preparat Histopatologi 1. Sediaan dipotong dengan microtom setebal 4 s/d 5 micron 2. Tempelkan potongan pada objekglas, lalu panaskan pada hotplat 3. Deparafinisasi dengan Xylol 1. 3 menit Xilol 2..... 3 menit 4. Cuci dengan ethanol, alkohol 90,80%,70%,masing-masing 20 celup 5. Cuci dengan air mengalir

6. Rendam dalam hamatoxylin.. 5 menit 7. Cuci dengan air mengalir... 3 menit 8. Rendam dalam lithium carbonat 0,5%. 4 celup 9. Cuci dengan air mengalir 10. Rendam dalam alcohol 70%.. 20 celup 11. Rendam dalam Eosin Phloxin 1%.. 1 menit 12. Cuci dengan air mengalir 30 celup 13. Rendam dalam alcohol 70%,80%,96%... 10-20 celup 14. Rendam dalam Carboxylol 2X 10-20 celup 15. Rendam dalam Xylol 2X 10-20 celup 16. Teteskan Entelan, lalu tutup dengan coverglas Formula for acid decalcifying agent Concentrated Hy drochloric acid. 15 ml Sodium chloride... 75 gr Distilled water. 1000 ml Hydrochloric acid 80 ml Formic acid. 100 ml Distiled water. 1000 ml Lithiumcarbonate 0.5% Lithiumcarbonate 0,5 gr Aquadest.. 100 ml Mayer hamatoxylin (Jim Millios) Hamatoxylin 5 gr Alumuniumamonium sulfate/tawas... 50 gr Sodium iodat 1gr Aquadest.. 700 ml Glicerol 300 ml Glacial acetic acid 10 ml

Prosedur pemeriksaan immunohistokimia 1. Sediaan dipotong dengan microtome setebal 4 s/d 5 micron -Blok paraffin sebaiknya disesuaikan dengan microtome yang kita pakai -Blok paraffin dicari yang ada lesi mukosa -Blok paraffin harus yang baik dan benar dalam prosesnya 2. Lekatkan pada objekglas yang telah di coating -Harap diperhatikan penomoran preparat dan nama antiboby -Lama waktu saat dalam waterbath -Suhu waterbath 3. Keringkan dan panaskan diatas hot plate -Sebaiknya dalam keadaan kering saat diatas hotplate -Simpan dalam incubatos 38 s/d 40 c semalam agar lebih kuat melekat 4. Deparafinisasi dengan xylol 5. Masukkan dalam ethanol 6.Masukkan dalam alcohol 90%,80% dan 70% 7. Cuci dengan air mengalir 8. Masukkan dalam H 2 O 2 dalam methanol dingin 9. Cuci dengan aquadest 10. Rendam dalam larutan citrate buffer,panaskan dalam microwave 2x 5 menit 11. Dinginkan dalam suhu ruangan 20 s/d 30 menit 12. Cuci dengan aquadest 13. Beri pembatas pada sekeliling sediaan dengan PAP pen 14. Cuci dengan PBS 5 menit 15. Teteskan bloking reagen, incubasi 10 s/d 20 menit -Lihat intruksi manual dari perusahaan -Harus dicuci PBS tidak? 16. Teteskan Primary antibody, incubasi 60 menit -Lihat intruksi manual -Berapa pengenceran yang disarankan -Berapa lama incubasi yang disarankan 17. Cuci dengan PBS 2x 5menit 18. Teteskan secondary antibody(link),incubasi 10s/d 20 menit

19. Cuci dengan PBS 2x 5menit 20. Teteskan streptavidin biotin, incubasi 10 s/d 20 menit 21. Cuci dengan PBS 2x 5menit 22. Teteskan DAB incubasi 5 s/d 10 menit 23.Cuci dengan air mengalir 5 menit 24.Counterstain dengan mayers haematoxilin 2 s/d 3 menit 25.Cuci dengan air mengalir 26.Dehydrasi dengan alcohol 70% s/d xylol 27.Mounting Citrat buffer (10 mm citric acid ph 6.0 ) Citric acid (anhydrous)...1.92 g Aquadest.. 1000 ml Sodium citrate buffer ( 10mM sodium citrate ph6.0 ) Tri-sodium citrate (dihydrat ).2.94 g Aquadest 1000 ml Phosphate Bufferd Saline (PBS) Na2HPO4.1,92 gr NaH2PO4..0,92 gr NaCL 5,90 gr Aquadest..1000 ml Mayers Hamatoxylin Hamatoxylin....1 gr Natrium jodat...0,2 gr Tawas...50 gr Aquadest..1000 ml Campurkan dan aduk sampai larut,lalu biarkan semalam. Keesokan harinya tambahkan : Chloral hydrat 50 gr

Asam citrate 1 gr Diaduk sampai larut, lalu didihkan selama 5 menit Sebelum dipakai harus disaring Proses jaringan dengan alat Tissue Processor Alkohol 70% 1jam Alkohol 80% 1 jam Alkohol 95% 1 jan Alkohol 95% 1 jam Ethanon 1 jam Ethanol. 1,5 jam Ethanol+Xylol. 1 jam Xilol 1. 1 jam Xilol 2...1 jam Parafin 1.. 1,5 jam Parafin 2 sisa waktu

Lampiran 7. Analisa Statistik Hasil Penelitian Perhitungan statistik sel radang Antrum/Pilorus. Anova untuk sel radang (Antrum/Pilorus) ANOVA Sel radang Sum of Squares df Mean Square F 44152.997 2 22076.499 19.696.000 17933.950 16 1120.872 62086.947 18 Uji Duncan untuk sel radang (Antrum/Pilorus) Lesi mukosa Negatif Positif Sel radang Subset f or alpha =.05 N 1 2 3 10 45.4000 5 118.2000 4 161.2500 1.000 1.000 1.000 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.455. of the group sizes is used. Ty pe I error lev els are not guaranteed. Perhitungan statistik sel mukus regio Antrum/Pilorus Anova untuk sel mukus (Antrum/Pilorus) ANOVA Sel goblet Sum of Squares df Mean Square F 108877.9 2 54438.958 9.149.004 71402.083 12 5950.174 180280.0 14 Uji Duncan untuk sel mukus (Antrum/Pilorus)

Lesi mukosa Negatif Positif Sel goblet Subset f or alpha =.05 N 1 2 6 11.6667 5 163.0000 4 206.2500 1.000.399 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.865. Perhitungan statistik sel parietal regio Antrum/Pilorus Anova untuk sel parietal (Antrum/Pilorus) ANOVA Sel parietal Sum of Squares df Mean Square F 31.121 2 15.561.721.501 345.300 16 21.581 376.421 18 Uji Duncan untuk sel parietal (Antrum/Pilorus) Lesi mukosa Positif Negatif Sel parietal Subset f or alpha =.05 N 1 4 5.0000 5 7.4000 10 8.3000.283 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.455.

Perhitungan statistik sel chief regio Antrum/Pilorus Anova untuk sel chief (Antrum/Pilorus) ANOVA Sel chief Sum of Squares df Mean Square F 106.437 2 53.218.010.990 87360.300 16 5460.019 87466.737 18 Uji Duncan untuk sel chief (Antrum/Pilorus) Lesi mukosa Negatif Positif Sel chief Subset f or alpha =.05 N 1 10 316.5000 5 319.2000 4 322.5000.901 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.455. Data Summary Lesi mukosa Negatif Positif Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Standard Mean Std Dev iation Error of Mean 45.40 29.33 9.27 11.67 3.50 1.43 8.30 5.85 1.85 316.50 81.93 25.91 7.33 1.86.76 118.20 27.96 12.50 163.00 120.29 53.79 7.40 1.67.75 319.20 26.95 12.05 78.00 19.67 8.80 161.25 48.53 24.27 206.25 67.00 33.50 5.00 2.94 1.47 322.50 89.53 44.77 102.00 39.30 19.65

Perhitungan statistik diameter lambung regio Fundus/Korpus Perbedaan diameter antara perlakuan lesi positif, perlakuan lesi negatif dan kontrol pada fundus/korpus ANOVA Diameter sagital (cm) Diameter transf ersal (cm) Sum of Squares df Mean Square F 4.082 2 2.041 1.333.290 26.030 17 1.531 30.112 19.396 2.198.463.637 7.264 17.427 7.660 19 Uji Duncan untuk diameter sagital dan tranversal pada fundus/korpus Fundus/korpus lesi negatif lesi positif Diameter sagital (cm) Subset f or alpha =.05 N 1 2 8.7000 10 9.8700 8 10.2875.097 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.138. Diameter transfersal (cm) Fundus/korpus lesi negatif lesi positif Subset f or alpha =.05 N 1 2 4.3000 10 4.5400 8 4.7500.362 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.138.

Perbedaan diameter antara perlakuan lesi positif, perlakuan lesi negatif dan kontrol pada fundus/korpus ANOVA Diameter sagital (cm) Diameter transf ersal (cm) Sum of Squares df Mean Square F.171 2.086.049.953 29.941 17 1.761 30.112 19.241 2.121.276.762 7.419 17.436 7.660 19 Uji Duncan untuk diameter sagital dan transversal pada fundus/korpus Fundus/korpus lesi positif lesi negatif Diameter sagital (cm) Subset f or alpha =.05 N 1 2 9.7500 10 9.8700 8 10.0250.782 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.138. Diameter transfersal (cm) Fundus/korpus lesi positif lesi negatif Subset f or alpha =.05 N 1 2 4.4000 10 4.5400 8 4.7250.512 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.138.

Perhitungan statistik diameter lambung regio Antrum/Pilorus Perbedaan diameter antara perlakuan lesi positif, perlakuan lesi negatif dan kontrol pada Antrum/Pilorus ANOVA Diameter sagital (cm) Diameter transf ersal (cm) Sum of Squares df Mean Square F 5.379 2 2.690 1.849.188 24.733 17 1.455 30.112 19 1.516 2.758 2.097.153 6.144 17.361 7.660 19 Uji Duncan untuk diameter sagital dan tranfersal pada Antrum/Pilorus Antrum/pilorus lesi negatif lesi positif Diameter sagital (cm) Subset f or alpha =.05 N 1 5 9.2400 10 9.8700 5 10.7000.062 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 6.000. Diameter transfersal (cm) Antrum/pilorus lesi negatif lesi positif Subset f or alpha =.05 N 1 5 4.2800 10 4.5400 5 5.0400.052 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 6.000.

Perhitungan statistik sel radang regio Fundus/Korpus Anova untuk sel radang (Fundus/korpus) ANOVA Sel radang Sum of Squares df Mean Square F 55521.543 2 27760.771 27.546.000 17132.457 17 1007.792 72654.000 19 Uji Duncan untuk sel radang (Fundus/korpus) Lesi mukosa Positif Negatif Sel radang Subset f or alpha =.05 N 1 2 3 10 33.2000 7 121.8571 3 165.0000 1.000 1.000 1.000 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.207. of the group sizes is used. Ty pe I error lev els are not guaranteed. Perhitungan statistik sel mukus regio Fundus/Korpus Anova untuk sel mukus (Fundus/korpus) ANOVA Sel goblet Sum of Squares df Mean Square F 136643.6 2 68321.786 11.715.001 87476.929 15 5831.795 224120.5 17

Uji Duncan untuk sel mukus regio Fundus/Korpus Lesi mukosa Positif Negatif Sel goblet Subset f or alpha =.05 N 1 2 8 12.2500 7 173.7143 3 213.0000 1.000.429 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.990. Perhitungan statistik sel Parietal regio Fundus/Korpus Anova untuk sel parietal (Fundus/korpus) ANOVA Sel parietal Sum of Squares df Mean Square F 17245.026 2 8622.513 2.971.078 49335.524 17 2902.090 66580.550 19 Uji Duncan untuk sel parietal (Fundus/Korpus) Lesi mukosa Negatif Positif Sel parietal Subset f or alpha =.05 N 1 3 197.3333 7 200.1429 10 258.0000.102 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.207.

Perhitungan statistik sel Chief regio Fundus/Korpus Anova untuk sel chief (Fundus/korpus) ANOVA Sel chief Sum of Squares df Mean Square F 2701.576 2 1350.788.194.826 118635.6 17 6978.566 121337.2 19 Uji Duncan untuk sel chief (Fundus/Korpus) Lesi mukosa Negatif Positif Sel chief Subset f or alpha =.05 N 1 3 250.6667 7 255.8571 10 277.3000.633 a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.207.

Ringkasan Data Lesi mukosa Negatif Positif Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Standard Mean Std Dev iation Error of Mean 33.20 15.79 4.99 12.25 6.73 2.38 258.00 61.37 19.41 277.30 98.19 31.05 10.50 2.88 1.02 165.00 40.85 23.59 213.00 82.71 47.75 197.33 21.50 12.41 250.67 41.68 24.06 187.00 91.28 52.70 121.86 43.88 16.58 173.71 110.66 41.83 200.14 49.18 18.59 255.86 68.79 26.00 166.14 76.02 28.73