BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN Tanaman-tanaman yang diteliti adalah Ricinus communis L. (jarak) dan Eclipta prostrata (L.) L. (urang-aring). Pada awal penelitian dilakukan pengumpulan bahan tanaman, yaitu biji jarak dan daun urang-aring yang berasal dari Perkebunan Manoko, Lembang, Kabupaten Bandung. Selanjutnya dilakukan determinasi di Herbarium Bandungense, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati ITB untuk mengetahui kebenaran identitas botani simplisia yang digunakan dalam penelitian. Hasil dari determinasi bahan tanaman tersebut menyatakan bahwa bahan tanaman yang digunakan adalah benar merupakan Ricinus communis L. (jarak) dan Eclipta prostrata (L.) L. (urang-aring). Pengolahan simplisia dilakukan melalui proses sortasi basah untuk memisahkan pengotor asing dan pencucia n untuk menghilangkan pengotor yang melekat pada simplisia, dilanjutkan dengan pengeringan. Pengeringan dilakukan untuk menghilangkan air dari simplisia sekaligus sehingga membantu proses ekstraksi karena penetrasi pelarut pada saat ekstraksi menjadi lebih mudah. Setelah dikeringkan, bahan-bahan tersebut diproses hingga menjadi simplisia halus. Karakterisasi simplisia dilakukan dengan tujuan untuk menjamin agar simplisia yang diteliti memenuhi persyaratan yang ditetapkan. Hasil dari karakterisasi simplisia dapat dilihat dalam tabel 4.1. Tabel 4.1 Hasil Karakterisasi Simplisia. Pemeriksaan Hasil ( % b/b) Biji Jarak Daun Urang-aring Kadar Abu Total 2,8 17,22 Kadar Sari Larut Etanol 43,13 7,91 Kadar Sari Larut Air 8,16 15,32 Kadar Air 3,97* 8,99* Keterangan: * = ( % v/b ) Kadar air simplisia biji jarak adalah sebesar 3,97% (v/b) dan daun urang-aring adalah sebesar 8,99%. Kedua parameter tersebut masih berada dalam persyaratan kadar air 39
4 simplisia yaitu maksimal 1% (v/b). Parameter kadar air simplisia ini penting karena air merupakan media yang baik untuk pertumbuhan mikroba dan air dapat memicu terjadinya reaksi enzimatis yang dapat menyebabkan perubahan kandungan kimia bahan, sehingga kadar air dalam simplisia diusahakan serendah mungkin. Penapisan fitokimia simplisia biji jarak menunjukkan hasil positif untuk golongan senyawa alkaloid dan flavonoid. Sedangkan, untuk simplisia daun urang-aring menunjukkan hasil positif untuk golongan senyawa flavonoid dan steroid/triterpenoid. Hasil penapisan fitokimia simplisia dan ekstrak dapat dilihat dalam tabel 4.2. Tabel 4.2 Hasil Penapisan Fitokimia Simplisia dan Ekstrak. Golongan Senyawa Simplisia Ekstrak Biji Jarak Daun Urang-aring Biji Jarak Daun Urang-aring Alkaloid + - + - Flavonoid + + + + Saponin - - - - Kuinon - - - - Tanin Tanin Galat - - - - Tanin Katekat - - - - Steroid/Triterpenoid - + - + Keterangan: + = simplisia mengandung golongan senyawa yang diujikan - = simplisia tidak mengandung golongan senyawa yang diujikan Proses ekstraksi simplisia dilakukan dengan metode ekstraksi panas menggunakan alat Refluks dengan pertimbangan bahwa adanya energi panas dapat meningkatkan penetrasi pelarut ke dalam simplisia sehingga zat yang terekstrak akan lebih banyak. Pelarut yang digunakan untuk mengekstraksi adalah etanol 95% dengan harapan senyawa nonpolar, semipolar, sampai polar dapat terekstraksi dengan baik. Persentase rendemen hasil ekstraksi simplisia biji jarak sebesar 46,86% dan daun urang-aring sebesar 15,57%. Karakterisasi ekstrak etanol yang dilakukan adalah penetapan kadar air ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring. Hasil karakterisasi ekstrak etanol biji jarak didapatkan kadar air sebesar 1,99%, sedangkan kadar air ekstrak etanol daun urang-aring sebesar 4,62%. Kedua ekstrak etanol menunjukkan kadar air di bawah 1% sehingga menunjang persyaratan kadar air yang ditetapkan. Ekstrak yang diperoleh juga dilakukan penapisan
41 fitokimia yang memberikan hasil positif alkaloid dan flavonoid untuk ekstrak biji jarak serta positif flavonoid dan steroid/triterpenoid untuk ekstrak daun urang-aring. Pengujian yang dilakukan terhadap Malassezia sp. semuanya menggunakan metode pengenceran agar karena distribusi pertumbuhan Malassezia sp. dalam medium SDA bila menggunakan difusi agar kurang baik. Pengamatan hasil pengujian dinyatakan negatif apabila tidak terlihat pertumbuhan Malassezia sp. pada permukaan medium uji yang mengandung larutan uji, sedangkan pengamatan hasil pengujian dinyatakan positif apabila terlihat pertumbuhan Malassezia sp. pada permukaan medium uji yang mengandung larutan uji. Semua pengamatan ini dibandingkan terhadap kontrol positif pertumbuhan Malassezia sp. pada medium uji yang mengandung etanol pro analisis. Pengujian aktivitas antifungi dilakukan terhadap ekstrak etanol biji jarak dan daun urangaring. Aktivitas antifungi biji jarak dan daun urang-aring terhadap Pityrosporum ovale, salah satu jenis dari genus Malassezia sp., telah diketahui berdasarkan penelitian sebelumnya, yaitu sebesar <,1 mg/ml media (Rahayu, 25), sehingga pengujian aktivitas antifungi dilakukan dengan membuat larutan uji dari ekstrak etanol kental biji jarak dan daun urang-aring sebesar 1% (b/v). Berdasarkan pengujian, diperoleh hasil bahwa kedua larutan uji memiliki aktivitas antifungi terhadap Malassezia sp. karena tidak teramati adanya pertumbuhan Malassezia sp. pada permukaan medium uji yang mengandung larutan uji. Oleh karena itu, pengujian dilanjutkan dengan penentuan konsentrasi hambat minimum (KHM) ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring terhadap Malassezia sp. Penentuan konsentrasi hambat minimum (KHM) ekstrak etanol biji jarak dan daun urangaring dilakukan dengan membuat larutan uji pada berbagai konsentrasi mulai dari konsentrasi terendah sampai tertinggi. KHM dinyatakan sebagai konsentrasi terkecil yang masih dapat menghambat pertumbuhan Malassezia sp. Berdasarkan pengujian, nilai KHM untuk ekstrak etanol biji jarak terhadap Malassezia sp. didapatkan sebesar 5 g/ml, sedangkan untuk ekstrak etanol daun urang-aring didapatkan nilai KHM sebesar,5 g/ml. Nilai KHM yang didapatkan dari daun urang-aring lebih rendah dibandingkan dengan biji jarak. Hal ini menunjukkan ekstrak etanol daun urang-aring memiliki keefektifan yang lebih tinggi daripada ekstrak etanol biji jarak dalam menghambat
42 pertumbuhan Malassezia sp. Hasil pengamatan penentuan KHM ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring dapat dilihat dalam gambar 4.1 dan 4.3. 1 2 3 4 Gambar 4.1 KHM biji jarak. Nomor 1 dan 2 = konsentrasi 5 ada pertumbuhan); 3 dan 4 = konsentrasi 25 pertumbuhan). g/ml (tidak g/ml (ada 1 2 3 4 Gambar 4.2 KHM daun urang-aring. Nomor 1 dan 2 = konsentrasi,5 g/ml media (tidak ada pertumbuhan); 3 dan 4 = konsentrasi,25 g/ml media (ada pertumbuhan). Penentuan aktivitas kombinasi ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring dilakukan dengan membuat perbandingan kombinasi berdasarkan KHM masing-masing ekstrak yang didapatkan dari percobaan. Kombinasi ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring yang digunakan dalam pengujian ini beserta hasil pengamatan aktivitasnya terhadap Malassezia sp. dapat dilihat dalam tabel 4.3 dan gambar 4.3.
43 Tabel 4.3 Hasil Pengamatan Aktivitas Kombinasi Ekstrak Etanol Biji Jarak dan Daun Urang-aring. Perbandingan Kombinasi Ekstrak Etanol Biji Jarak Daun Urang-aring Pengamatan (KHM) (KHM) 1 - - - 1-1 1 - ¾ ¾ - 1 ½ - ½ 1 - ½ ½ - ½ ¼ + ¼ ½ + ¼ ¾ + ¾ ¼ + Keterangan: + = terlihat pertumbuhan Malassezia sp. - = tidak terlihat pertumbuhan Malassezia sp. Pengamatan dilakukan duplo 1 KHM Biji Jarak = 5 g/ml; 1 KHM Daun Urang-aring =,5 g/ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11* 12* 13* 14* 15* 16* 17* 18* Gambar 4.3 Hasil pengujian kombinasi ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring. Kombinasi dalam KHM biji jarak : KHM daun urang-aring. Nomor 1 dan 2 = (1 : 1); 3 dan 4 = (¾ : ¾); 5 dan 6 = (1 : ½); 7 dan 8 = (½ : 1); 9 dan 1 = (½ : ½); 11 dan 12 = (½ : ¼); 13 dan 14 = (¼ : ½); 15 dan 16 = (¼ : ¾); 17 dan 18 = (¾ : ¼). * = ada pertumbuhan.
44 Dari hasil pengamatan terhadap pengujian aktivitas kombinasi ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring diperoleh hasil bahwa perbandingan kombinasi KHM biji jarak dan KHM daun urang-aring pada (1 : 1) dan (¾ : ¾) tidak terlihat adanya pertumbuhan Malassezia sp. Kemudian, pengujian dilanjutkan dengan kombinasi KHM biji jarak dan KHM daun urang-aring pada (1 : ½) dan (½ : 1). Pengujian ini juga memberikan hasil tidak terlihat adanya pertumbuhan Malassezia sp. yang berarti pada konsentrasi tiap ekstrak etanol pada ½ KHM masing-masing ketika dikombinasikan dengan ekstrak etanol lain pada KHM-nya masih menunjukkan aktivitas menghambat pertumbuhan Malassezia sp. Kemudian, komposisi kombinasi diturunkan menjadi (½ : ½) dan masih memperlihatkan tidak adanya pertumbuhan Malassezia sp. Perbandingan kombinasi ini menunjukkan sifat aditif. Kombinasi (½ : ½) ini bersifat aditif karena pada konsentrasi tersebut didapatkan nilai Fraksi Konsentrasi Inhibisi (FKI) yang sama dengan satu. Untuk menguji aktivitas kombinasi lebih jauh, dilakukan pengujian pada kombinasi (½ : ¼) dan (¼ : ½) yang apabila memberikan hasil tidak teramati pertumbuhan Malassezia sp. maka kombinasi ini dapat dinyatakan sinergis karena memiliki nilai FKI yang kurang dari satu. Berdasarkan hasil pengamatan, ternyata pada kombinasi ini terlihat pertumbuhan Malassezia sp. sehingga kombinasi ini tidak bersifat sinergis. Kemudian, pengujian kembali dicoba untuk melihat apakah faktor ¼ KHM ini yang menyebabkan pertumbuhan Malassezia sp. dengan membuat kombinasi pada (¼ : ¾) dan (¾ : ¼). Hasil pengamatan pada kombinasi ini menunjukkan terlihat pertumbuhan Malassezia sp. sehingga diduga konsentrasi ¼ KHM ini sudah tidak mampu menghambat pertumbuhan Malassezia sp. ketika dikombinasikan dengan ekstrak lain pada KHM yang masih mampu beraktivitas terhadap Malassezia sp. Aktivitas antimikroba dari biji jarak diduga berasal dari senyawa flavonoid di dalamnya seperti yang terlihat dari penapisan fitokimia simplisia dan ekstrak etanolnya. Kandungan flavonoid dalam tanaman jarak juga telah dibuktikan aktivitasnya sebagai antimikroba melalui penelitian Upasani et. al. (23). Berdasarkan pustaka, daun urang-aring pun memiliki gugus fenol dalam asam fenolik karboksilat yang diduga berperan sebagai antimikroba. Antifungi yang digunakan dalam penetapan kesetaraan aktivitas ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring dengan antifungi pembanding terhadap Malassezia sp. adalah ketokonazol. KHM ketokonazol terhadap Malassezia sp. diperoleh sebesar,5 g/ml. Ekstrak etanol biji jarak sebesar 5 µg ekstrak/ml dan daun urang-aring sebesar
45 5 µg ekstrak/ml setara dengan,5 g/ml ketokonazol. Berdasarkan hasil pengujian ini, ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring memiliki aktivitas antifungi yang lebih rendah dibandingkan dengan antifungi pembanding. Pengujian iritasi dilakukan sebagai salah satu kelayakan dalam pengembangan sediaan farmasi yang diberikan secara topikal. Pengujian iritasi dilakukan melalui penetapan iritasi dermal dan mata akut pada kelinci. Larutan uji disiapkan dengan membuat suspensi ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring dalam air suling, kemudian dibuat konsentrasi sebesar 4 kali dari konsentrasi hambat minimumnya (KHM). Digunakan air suling sebagai pembawa karena air suling tidak bersifat mengiritasi pada kulit dan mata sehingga diharapkan iritasi yang terjadi merupakan efek yang timbul dari ekstrak etanol yang digunakan tanpa dipengaruhi oleh faktor pembawa. Konsentrasi larutan uji dibuat sebesar 4 kali dari KHM dengan mengacu pada nilai Minimum Bactericidal Concentration (MBC) untuk antibiotik golongan -laktam dan glikopeptida terhadap beberapa mikroba yang umumnya sebesar 32 x KHM. Kombinasi ekstrak etanol biji jarak dan daun urangaring yang digunakan dalam pengujian ini adalah kombinasi yang menunjukkan sifat aditif yaitu pada kombinasi KHM biji jarak dan daun urang-aring sebesar ½ KHM : ½ KHM. Hasil dari pengujian iritasi pada kulit dan mata kelinci dapat dilihat dalam tabel 4.4. Berdasarkan hasil pengujian tersebut, ekstrak etanol biji jarak hanya memberikan skor,33 (maksimum 4) untuk iritasi konjungtiva mata pada jam ke-1, yaitu ditunjukkan hanya kelinci ke-3 yang memberikan skor 1. Begitu pula dengan kombinasi ekstrak etanol biji jarak dan daun urang-aring pada perbandingan ½ KHM : ½ KHM hanya memberikan skor,33 (maksimum 4) untuk iritasi konjungtiva mata pada jam ke-1, yaitu ditunjukkan hanya kelinci ke-1 yang memberikan skor 1. Namun, iritasi tidak terjadi pada parameter pengujian yang lain termasuk parameter iritasi dermal. Berdasarkan hasil tersebut, ekstrak etanol biji jarak dan kombinasinya dengan daun urang-aring hanya memperlihatkan efek mengiritasi konjungtiva mata sangat ringan pada jam ke-1 saja, dan tidak memperlihatkan efek mengiritasi dermal pada kelinci. Sedangkan, ekstrak etanol daun urang-aring tidak memberikan skor iritasi pada semua parameter pengujian (dermal dan mata) yang berarti ekstrak tersebut tidak memperlihatkan efek mengiritasi dermal dan mata pada kelinci. Berdasarkan keseluruhan parameter pengujian, ekstrak etanol biji jarak dan kombinasinya dengan daun urang-aring praktis tidak mengiritasi mata dan tidak mengiritasi dermal kelinci, sedangkan daun urang-aring tidak mengiritasi mata dan dermal kelinci.
Tabel 4.4 Hasil Pengamatan Uji Iritasi Dermal dan Mata Kelinci 46 Jam ke- Zat Uji Kelinci Skor Kulit Skor Mata Eritema & Eschar Edema Kornea Iris Konjungtiva Khemosis 1 BJ 2 mg/1 ml UA,2 mg/1 ml Kombinasi KHM BJ : UA ½ : ½ I II III 1 I II III I 1 II III 24 BJ 2 mg/1 ml UA,2 mg/1 ml Kombinasi KHM BJ : UA ½ : ½ I II III I II III I II III 48 BJ 2 mg/1 ml UA,2 mg/1 ml Kombinasi KHM BJ : UA ½ : ½ I II III I II III I II III 72 BJ 2 mg/1 ml UA,2 mg/1 ml Kombinasi KHM BJ : UA ½ : ½ I II III I II III I II III Keterangan: BJ = ekstrak etanol biji jarak UA = ekstrak etanol daun urang-aring