ISOLASI PROTEASE DARI BUAH LABU SIAM (Sechium edule (Jacq.) Sw.) DENGAN TEKNIK SALTING OUT MENGGUNAKAN GARAM AMMONIUM SULFAT SKRIPSI Oleh : Ni Wayan Lia Kusumaningrum 1108105014 JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA BUKIT JIMBARAN 2015
ISOLASI PROTEASE DARI BUAH LABU SIAM (Sechium edule (Jacq.) Sw.) DENGAN TEKNIK SALTING OUT MENGGUNAKAN GARAM AMMONIUM SULFAT SKRIPSI Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains (S.Si) di Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana Oleh : Ni Wayan Lia Kusumaningrum NIM.1108105014 Menyetujui : Pembimbing I Pembimbing II (Ketut Ratnayani, S.Si., M.Si.) (Dra. Emmy Sahara, M.Sc. (Hons).) NIP. 19710609 199702 2 001 NIP. 19650616 199103 2 002 Mengesahkan Ketua Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana (Anak Agung Bawa Putra, S.Si., M.Si.) NIP. 19680602 199601 1 001 ii
ISOLASI PROTEASE DARI BUAH LABU SIAM (Sechium edule (Jacq.) Sw.) DENGAN TEKNIK SALTING OUT MENGGUNAKAN GARAM AMMONIUM SULFAT Oleh : Ni Wayan Lia Kusumaningrum NIM.1108105014 Skripsi ini disidangkan di Bukit Jimbaran Pada Kamis, 2 Juli 2015 Tim penguji sidang skripsi Ketua Sekretaris (Ketut Ratnayani, S.Si., M.Si.) (Dra. Emmy Sahara, M.Sc. (Hons).) NIP. 19710609 199702 2 001 NIP. 19650616 199103 2 002 Anggota (Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si.) NIP. 19710219 199702 1 001 (Oka Ratnayani, S.Si., M.Si., Ph.D.) NIP. 19730105 199903 2 002 (Ir. I. G. A. Kunti Sri Panca Dewi, M.Si.) NIP. 19640903 199103 2 002 iii
KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat dan rahmat-nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul ''Isolasi Enzim Protease Dari Buah Labu Siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.) Dengan Teknik Salting Out Menggunakan Ammonium Sulfat''. Pembuatan Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan di Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Sejak awal penulisan hingga terselesaikannya Skripsi ini, penulis telah banyak mendapat bimbingan, nasihat, saran, motivasi, serta bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Ibu Ketut Ratnayani, S,Si., M.Si selaku dosen pembimbing I dan Ibu Dra. Emmy Sahara, M.Sc. (Hons) selaku dosen pembimbing II sekaligus pembimbing akademis atas saran, waktu, tenaga, pikiran, dan kesabarannya dalam memberikan bimbingan dan pengarahan dalam penyusunan skripsi ini. 2. Bapak Anak Agung Bawa Putra, S.Si., M.Si selaku Ketua Jurusan Kimia, FMIPA, UNUD dan Bapak Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., selaku Sekretaris Jurusan Kimia, FMIPA, UNUD. 3. Seluruh panitia Tugas Akhir di Jurusan Kimia, FMIPA, UNUD yang telah banyak membantu dalam kelancaran registrasi dan administrasi Tugas Akhir selama ini. iv
4. Seluruh dosen dan staf tata usaha di Jurusan Kimia dan FMIPA yang telah memberi tambahan ilmu, motivasi serta kelancaran administrasi dalam penyusunan skripsi ini. 5. Dewa Ayu Ika Pramitha, S.Si., selaku staf Laboratorium Bersama FMIPA, UNUD yang telah banyak membantu penulis selama menggunakan instrumen Spektrofotometer UV-Vis di Laboratorium Bersama MIPA dan seluruf staf dan laboran di Laboratorium FTP, UNUD yang telah memberikan fasilitas tempat penelitian. 6. Bapak I Made Gunawan, S.P. selaku Kepala Desa Kertha serta keluarga yang telah bersedia memberikan buah labu siam untuk digunakan dalam penelitian. 7. Bapak Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. dan ibu Ir. Ni Luh Komang Kusumawati yang telah membantu dan menemani survey untuk memperoleh buah labu siam. 8. Orang tua tercinta, I Wayan Kompiang, SE dan Ni Ketut Suci Asih, adik : Ni Kadek Ayu Melly Febriyanti yang telah banyak memberi dukungan, doa, dan semangat selama ini. 9. I Gede Andy Andika Parahita yang selalu memberikan semangat, dukungan, doa, sabar, serta telah meluangkan waktu untuk membantu dalam menyelesaikan skripsi ini. 10. Teman-teman seperjuangan, Hany Anastasia, Sukma Sanjiwani, Rusma Eva, Tutut Hardikawati, Putu Yuliantari, Rahma Prabawanti, Desak Adi Capayanti, Wayan Hermawan, Saeful Bahri, Dupi Andika, Kadek Ariesta, Egi Azikin Maulana, Muhammad Nazib dan teman-teman angkatan 2011 v
yang telah banyak memberikan motivasi, dukungan dan bantuan selama perkuliahan serta penyusunan Tugas Akhir ini. 11. Semua pihak yang telah membantu yang tidak bisa disebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa dalam skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan. Penulis mengharapkan agar tulisan ini dapat bermanfaat dan dapat memberikan sumbangan terhadap perkembangan ilmu pengetahuan. Bukit Jimbaran, Juni 2015 Penulis vi
DAFTAR ISI Halaman LEMBAR PENGESAHAN... ii TIM PENGUJI SIDANG SKRIPSI... iii ABSTRAK.... iv ABSTRACT... v KATA PENGANTAR... vi DAFTAR ISI... ix DAFTAR GAMBAR... xi DAFTAR TABEL... xii DAFTAR LAMPIRAN... xiii BAB I PENDAHULUAN... 1 1.1 Latar Belakang Penelitian... 1 1.2 Rumusan Masalah... 4 1.3 Tujuan Penelitian... 4 1.4 Manfaat Penelitian... 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 6 2.1 Labu Siam... 6 2.2 Protease Tumbuhan.... 8 2.3 Klasifikasi Protease... 10 2.4 Metode Fraksinasi Salting Out... 14 2.5 Ammonium Sulfat ((NH4)2SO4)...... 15 2.6 Penentuan Konsentrasi Protein Total dengan Metode Biuret...... 16 2.7 Penentuan Aktivitas Protease...... 17 2.8 Tirosin...... 19 2.9 Spektrofotometri UV-Vis...... 20 2.10 Penentuan Aktivitas Spesifik...... 21 BAB III METODOLOGI PENELITIAN... 22 3.1 Bahan dan Peralatan Penelitian... 22 3.1.1 Bahan Penelitian... 22 3.1.2 Alat penelitian... 22 3.2 Tempat Penelitian... 22 3.3 Metode Penelitian... 23 3.3.1 Preparasi Ekstrak Protease Kasar... 23 3.3.2 Isolasi Enzim Protease Menggunakan Metode Salting Out dengan Ammonium Sulfat... 23 3.3.4 Pengujian Aktivitas Protease Enzim Protease... 25 3.3.5 Penentuan Konsentrasi Protein dengan Metode Biuret... 29 3.3.6 Penentuan Aktivitas Spesifik... 30 vii
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 32 4.1 Preparasi ekstrak kasar protease buah labu siam... 33 4.2 Penentuan aktivitas protease dari ekstrak kasar dan fraksi hasil salting out protease buah labu siam... 35 4.3 Kadar protein dari ekstrak kasar dan fraksi hasil salting out protease buah labu siam.... 44 4.4 Aktivitas spesifik protease dari ekstrak kasar dan fraksi hasil salting out protease buah labu siam... 49 BAB V SIMPULAN DAN SARAN... 54 5.1 Simpulan... 54 5.2 Saran... 54 DAFTAR PUSTAKA... 55 LAMPIRAN... 59 CURRICULUM VITAE... 102 viii
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Labu siam... 6 Gambar 2.2 Reaksi hidrolisis ikatan peptida oleh protease... 8 Gambar 2.3 Mekanisme umum hidrolisis enzimatik substrat peptida... 9 Gambar 2.4 Mekanisme reaksi hidrolisis oleh sistein protease... 11 Gambar 2.5 Mekanisme reaksi hidrolisis oleh aspartat protease... 13 Gambar 2.6 Kompleks Cu 2+ dengan gugus NH pada ikatan peptida dalam suasana basa... 17 Gambar 2.7 Struktur Tirosin... 19 Gambar 4.1 Reaksi hidrolisis kasein oleh protease... 36 Gambar 4.2 Kurva L-Tirosin standar... 38 Gambar 4.3 Gambar 4.4 Grafik aktivitas protease dari ekstrak kasar protease, fraksi 0-20%, fraksi 20-50% dan fraksi 50-70%... 42 Grafik aktivitas protease fraksi 20-30%, fraksi 30-40% dan fraksi 40-50%... 43 Gambar 4.5 Kurva BSA standar... 46 Gambar 4.6 Grafik kadar protein ekstrak kasar protease, fraksi 0-20%, fraksi 20-50% dan fraksi 50-70%... 47 Gambar 4.7 Gambar 4.8 Gambar 4.9 Grafik kadari protein fraksi 20-30%, fraksi 30-40% dan fraksi 40-50%... 49 Grafik aktivitas spesifik dari ekstrak kasar protease, fraksi 0-20%, fraksi 20-50% dan fraksi 50-70%... 51 Grafik aktivitas spesifik fraksi 20-30%, fraksi 30-40% dan fraksi 40-50%... 52 ix
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 2.1 Kandungan gizi buah labu siam.... 7 Tabel 3.1 Tahap penambahan/perlakuan dalam pembuatan kurva tirosin standar... 26 Tabel 3.2 Tahap penambahan/perlakuan dalam penentuan aktivitas protease... 28 Tabel 3.3 Tahap penambahan/perlakuan dalam pembuatan kurva BSA standar... 30 Tabel 4.1 Jumlah tirosin sebelum inkubasi, sesudah inkubasi dan hasil hidolisis ekstrak kasar protease, fraksi 0-20%, fraksi 20-50% dan fraksi 50-70%... 39 Tabel 4.2 Jumlah tirosin sebelum inkubasi, sesudah inkubasi dan hasil hidrolisis dari fraksi 20-30%, 30-40% dan 40-50%... 40 Tabel 4.3. Hasil pengujian aktivitas protease dari ekstrak kasar protease, fraksi 0-20%, fraksi 20-50% dan fraksi 50-70%... 41 Tabel 4.4. Hasil pengujian aktivitas protease fraksi 20-30%, fraksi 30-40% dan fraksi 40-50%... 43 Tabel 4.5 Kadar protein total buah labu siam ekstrak kasar enzim, fraksi 0-20%, fraksi 20-50% dan fraksi 50-70%... 47 Tabel 4.6. Kadar protein total buah labu siam fraksi 20-30%, fraksi 30-40% dan fraksi 40-50%... 48 Tabel 4.7 Aktivitas spesifik protease dari ekstrak kasar protease, fraksi 0-20%, fraksi 20-50% dan fraksi 50-70%... 50 Tabel 4.8 Aktivitas spesifik protease fraksi 20-30%, fraksi 30-40% dan fraksi 40-50%... 52 x
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Skema Penelitian Secara Garis Besar... 59 Lampiran 2. Lampiran 3. Isolasi Enzim Protease Menggunakan Metode Salting Out dengan Garam Ammonium Sulfat... 60 Pengujian Aktivitas Protease Enzim Protease Buah Labu Siam... 62 Lampiran 4. Penentuan Konsentrasi Protein Total dengan Metode Lowry. 64 Lampiran 5. Pembuatan Larutan Garam Ammonium Sulfat Jenuh... 66 Lampiran 6. Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9. Pembuatan Larutan Untuk Pengujian Aktivitas Protease Enzim... 68 Pembuatan Larutan Untuk Penentuan Konsentrasi Protein... 74 Data Penentuan Panjang Gelombang Maksimum L-Tirosin Standar... 76 Perhitungan Persamaan Regresi Linear dan Koefisien Regresi Linear pada L-Tirosin Standar... 77 Lampiran 10. Data Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Protein BSA (Bovine Serum Albumin)... 80 Lampiran 11. Perhitungan Persamaan Regresi Linear dan Koefisien Regresi Linear pada Standar BSA (Bovine Serum albumin).. 81 Lampiran 12. Perhitungan Aktivitas Protease Buah Labu Siam... 84 Lampiran 13. Perhitungan Protein Total Buah Labu Siam... 91 Lampiran 14. Aktivitas Spesifik Protease Buah labu siam... 95 Lampiran 15. Perhitungan Standar Deviasi... 97 Lampiran 16. Dokumentasi Penelitian... 108 xi