SNI -97-6 Standar Nasional Indonesia Susu bubuk ICS 67.. Badan Standardisasi Nasional
Daftar isi Prakata Daftar isi...i...ii Ruang lingkup... Istilah dan definisi... Komposisi... 4 Syarat mutu... 5 Pengambilan contoh... 6 Cara uji... 7 Syarat lulus uji... 8 Higiene... 9 Pengemasan... Syarat penandaan... Lampiran A (normatif) Metode pengambilan contoh susu bubuk... 4 Lampiran B (normatif) Cara uji parameter syarat mutu susu bubuk... 8 Bibliografi... 8 Tabel Syarat mutu susu bubuk... Tabel A. Nilai N, n dan c untuk berat bersih sama atau kurang dari kg (, lb)...5 Tabel A. Nilai N, n dan c untuk berat bersih lebih dari kg (, lb)...6 tapi tidak lebih dari 4,5 kg ( lb)...6 Tabel A. Nilai N, n dan c untuk berat bersih lebih dari 4,5 kg ( lb)...6 Tabel A.4 Nilai N, n dan c untuk berat bersih sama atau kurang dari kg (, lb)...6 Tabel A.5 Nilai N, n dan c untuk berat bersih lebih dari kg (, lb) tapi tidak lebih dari 4,5kg ( lb)...7 Tabel A.5 Nilai N, n dan c untuk berat bersih lebih dari 4,5 kg ( lb)... 7 Tabel B. Reaksi biokimia E. coli pada uji IMVIC... 7 Tabel B. APM/MPN per g contoh bila menggunakan tabung... 8 untuk setiap tingkat pengenceran,;,; dan, g/ml contoh... 8 Tabel B.4 Reaksi biokimia dan serologi salmonella... 6 Tabel B.5 Reaksi biokima dan serologi untuk Salmonella... 7 i
Prakata Standar Nasional Indonesia (SNI) Susu bubuk ini merupakan revisi dari SNI. -97-999, Susu bubuk. Perumusan standar ini telah disusun oleh Panitia Teknis 67-4 Makanan dan Minuman. Tujuan penyususnan standar ini sebagai acuan sehingga susu bubuk yang beredar di pasar dapat terjamin mutu dan kemanannya. Dalam merumuskan SNI ini telah memperhatikan hal-hal yang tertera dalam:. Undang-undang RI No. 7 Tahun 996 tentang Pangan. Undang-undang RI No. 8 Tahun 999 tentang Perlindungan Konsumen. Peraturan Pemerintah No. 69 Tahun 999 tentang Label dan Iklan Pangan 4. Keputusan Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan No.75/B/SK/VII/89 tentang Batas Maksimum Cemaran Logam dalam Makanan 5. Keputusan Direktorat Jendral Batas Maksimum Cemaran Mikroba dalam Makanan Standar ini telah dibahas melalui rapat-rapat teknis dan rapat pra konsensus pada tanggal September 5 dan terakhir dibahas dalam Rapat Konsensus Nasional pada tanggal 4 November 5 di Jakarta. Hadir dalam rapat tersebut wakil-wakil dari Produsen, Asosiasi. Laboratorium Penguji, Eksportir dan Instasi Terkait. ii
Ruang lingkup Susu bubuk Standar ini menetapkan syarat mutu, pengambilan contoh dan cara uji susu bubuk. Istilah dan definisi. susu bubuk produk susu yang diperoleh dengan cara mengurangi sebagian besar air melalui proses pengeringan susu segar dan atau susu rekombinasi yang telah dipasteurisasi, dengan atau tanpa penambahan vitamin, mineral, dan bahan tambahan pangan yang diizinkan. Susu bubuk meliputi susu bubuk berlemak, rendah lemak dan tanpa lemak. susu bubuk berlemak susu bubuk yang tidak diambil lemaknya. susu bubuk kurang lemak susu bubuk yang telah dikurangi sebagian lemaknya.4 susu bubuk bebas lemak susu bubuk yang telah diambil lemaknya.5 susu rekombinasi produk susu yang diperoleh dengan cara melarutkan kembali susu bubuk dengan air, dan atau dicampur susu segar, dengan atau tanpa penambahan vitamin, mineral, dan bahan tambahan pangan yang diizinkan Komposisi. Bahan baku utama susu segar dan atau susu rekombinasi. Bahan tambahan pangan bahan tambahan pangan yang diijinkan untuk produk susu yang sesuai dengan peraturan berlaku dari 8
4 Syarat mutu Syarat mutu susu bubuk sesuai Tabel di bawah ini. Tabel No. Kriteria uji Satuan Keadaan Syarat mutu susu bubuk Susu bubuk berlemak Persyaratan Susu bubuk Kurang lemak Bau - normal normal normal Rasa - normal normal normal Susu bubuk bebas lemak Kadar air % b/b Maks. 5 maks. 5 maks. 5 Lebih dari,5 Lemak % b/b Min. 6 kurang dari maks.,5 6, 4 Protein (N x 6,8) % b/b Min. min. min. 5 Cemaran logam ** Tembaga (Cu) mg/kg Maks., maks., maks., Timbal (Pb) mg/kg Maks., maks., maks., Timah (Sn) mg/kg Maks. 4,/5,* maks. 4,/5,* maks. 4,/5,* Raksa (Hg) mg/kg Maks., maks., maks., 6 Cemaran arsen (As)** mg/kg Maks., maks., maks., 7 Cemaran mikroba Angka lempeng total Koloni/g Maks. 5 x 4 maks. 5 x 4 maks. 5 x 4 Bakteri coliform APM/g Maks. maks. maks. Escherichia coli APM/g < < < Staphylococcus aureus koloni/g Maks. x maks. x maks. x Salmonella koloni/g Negatif * untuk kemasan kaleng ** dihitung terhadap makanan yang siap dikonsumsi 5 Pengambilan contoh Negatif Negatif Cara pengambilan contoh seperti tercantum pada lampiran A. dari 8
6 Cara uji Cara uji untuk semua parameter syarat mutu susu bubuk seperti di bawah ini: a) Cara uji keadaan seperti pada Lampiran B. - Cara uji bau seperti pada Lampiran B.. - Cara uji rasa seperti pada Lampiran B.. b) Cara uji kadar air seperti pada Lampiran B. c) Cara uji kadar lemak seperti pada Lampiran B.4 d) Cara uji protein seperti pada Lampiran B.5 e) Cara uji cemaran logam seperti pada Lampiran B.6 - Cara uji tembaga (Cu) dan timbal (Pb) seperti pada Lampiran B.6. - Cara uji timah (Sn) seperti pada Lampiran B.6. - Cara uji raksa (Hg) seperti pada Lampiran B.6. f) Cara uji arsen (As) seperti pada Lampiran B.7 g) Cara uji cemaran mikroba seperti pada Lampiran B.8 - Cara uji angka lempeng total seperti pada Lampiran B.8. - Cara uji bakteri coliform dan Escherichia coli seperti pada Lampiran B.8. - Cara uji Staphylococcus aureus seperti pada Lampiran B.8.4 - Cara uji Salmonella seperti pada Lampiran B.8.5 7 Syarat lulus uji Produk dinyatakan lulus uji apabila memenuhi syarat mutu sesuai butir 5. 8 Higiene Cara memproduksi produk yang higienis termasuk cara penyiapan dan penanganannya mengacu pada peraturan yang berlaku, tentang pedoman cara produksi pangan yang baik. 9 Pengemasan Susu bubuk dikemas dalam wadah yang tertutup rapat, tidak dipengaruhi atau mempengaruhi isi, aman selama penyimpanan dan pengangkutan. Syarat penandaan Syarat penandaan sesuai dengan peraturan perundang-undangan yang berlaku tentang label dan iklan pangan. dari 8
A. Prinsip Lampiran A (normatif) Metode pengambilan contoh susu bubuk Pengambilan contoh susu bubuk yang dikemas dengan cara melihat banyaknya unit contoh yang cacat pada AQL 6,5 dan contoh diambil secara acak. A. Penerapan pengambilan contoh A.. Informasi yang diperlukan Dalam menggunakan rancangan pengambilan contoh dalam Lampiran A. diperlukan beberapa informasi sebagai berikut: a) Tingkat inspeksi; b) Ukuran lot (N); c) Ukuran kemasan terkecil (berat bersih dalam kg); d) Ketentuan standar mengenai kualitas produk yang dikehendaki, misalkan penggolongan cacat dan jumlah cacat yang diperbolehkan dari sejumlah lot yang diperiksa. A.. Inspeksi a) Pemilihan tingkat inspeksi berdasarkan: Tingkat inspeksi I, digunakan untuk pengambilan contoh normal (biasa). Tingkat inspeksi II, digunakan untuk pengambilan contoh bila terjadi sanggahan terhadap hasil pengujian menurut tingkat inspeksi I, atau bila diperlukan hasil pengujian yang lebih menyakinkan. b) Tentukan ukuran lot (N), misalkan jumlah kemasan terkecil susu bubuk c) Tentukan ukuran contoh (n) yang akan diambil dari suatu lot yang diperiksa, yang didasarkan pada ukuran lot, ukuran kemasan terkecil, dan tingkat inspeksi. Penentuan ukuran contoh dapat dilihat pada Lampiran A.. d) Ambil secara acak sejumlah ukuran contoh (n) yang diperlukan dari lot e) Uji produk berdasarkan standar. Identifikasi setiap kemasan atau unit contoh yang tidak memenuhi spesifikasi yang terdapat dalam persyaratan standar dan dinyatakan cacat berdasarkan penggolongan cacat yang terdapat dalam standar. f) Gunakan rancangan pengambilan contoh pada Lampiran A. g) Nyatakan bahwa lot diterima jika cacat sama atau kurang dari jumlah cacat yang diperbolehkan (c) dan lot ditolak jika cacat melebihi jumlah cacat yang diperbolehkan (c). A.. Penerapan rancangan pengambilan contoh A... Tingkat inspeksi I Misalkan lot terdiri dari karton yang berisi kemasan berukuran x 4 g setiap kartonnya. Keputusan diambil menggunakan Tingkat Inspeksi I karena produk tersebut belum pernah diuji dan belum pernah mendapat sanggahan mengenai kualitasnya. a. Ukuran lot (N) :. x atau 4.4 unit 4 dari 8
b. Ukuran kemasan : 4 g c. Tingkat inspeksi : I (lihat rancangan pengambilan contoh, lampiran A.) d. Ukuran contoh (n) : e. Jumlah maksimum cacat yang diterima (c) : Lot diterima apabila jumlah cacat yang ditemukan dari contoh yang diuji sama atau kurang dari dan lot ditolak apabila jumlah cacat yang ditemukan dari kemasan yang diuji lebih besar dari. A... Tingkat inspeksi II Bila hasil pengujian pertama mendapat sanggahan (A...) maka harus dilakukan pemeriksaan ulangan terhadap lot tersebut dengan ukuran contoh yang lebih banyak sesuai dengan tingkat inspeksi II. a. Ukuran lot (N) :. x atau 4.4 unit b. Ukuran kemasan : 4 g c. Tingkat inspeksi : II (lihat rancangan pengambilan contoh, lampiran A.) d. Ukuran contoh (n) : e. Jumlah maksimum cacat yang diterima (c) : A..4 Catatan mengenai ukuran contoh Tidak perlu membatasi ukuran contoh sebagai minimum untuk ukuran lot dan tingkat inspeksi yang tepat. Dalam semua kasus, contoh yang lebih besar dapat dipilih. Dalam contoh A... perkiraan yang lebih dipercaya mengenai mutu lot dapat dibuat dengan mengambil contoh sebanyak 9 atau 48 dan menggunakan jumlah ketentuan, yang diterima berturut-turut sebanyak 4 dan 6. A. Rancangan pengambilan contoh A.. Rancangan pengambilan contoh (Tingkat inspeksi I, AQL = 6,5) Tabel A. Nilai N, n dan c untuk berat bersih sama atau kurang dari kg (, lb) Ukuran lot (N) Ukuran contoh (n) Jumlah maksimum cacat yang diterima (c) 4.8 atau kurang 6 4.8 4. 4. 48. 48. 84. 9 4 84. 44. 48 6 44. 4. 84 9 Lebih dari 4. 6 5 dari 8
Tabel A. Nilai N, n dan c untuk berat bersih lebih dari kg (, lb) tapi tidak lebih dari 4,5 kg ( lb) Ukuran lot (N) Ukuran contoh (n) Jumlah maksimum cacat yang diterima (c).4 atau kurang 6.4 5. 5. 4. 4. 4. 9 4 4. 7. 48 6 7.. 84 9 Lebih dari. 6 Tabel A. Nilai N, n dan c untuk berat bersih lebih dari 4,5 kg ( lb) Ukuran lot (N) Ukuran contoh (n) Jumlah maksimum cacat yang diterima (c) 6 atau kurang 6 6.. 7. 7. 5. 9 4 5. 4. 48 6 4. 4. 84 9 Lebih dari 4. 6 A.. Rancangan pengambilan contoh (Tingkat inspeksi II, AQL = 6.5) Tabel A.4 Nilai N, n dan c untuk berat bersih sama atau kurang dari kg (, lb) Ukuran lot (N) Ukuran contoh (n) Jumlah maksimum cacat yang diterima (c) 4.8 atau kurang 4.8 4. 4. 48. 9 4 48. 84. 48 6 84. 44. 84 9 44. 4. 6 Lebih dari 4. 9 6 dari 8
Tabel A.5 Nilai N, n dan c untuk berat bersih lebih dari kg (, lb) tapi tidak lebih dari 4,5kg ( lb) Ukuran lot (N) Jumlah maksimum cacat Ukuran contoh (n) yang diterima (c).4 atau kurang.4 5. 5. 4. 9 4 4. 4. 48 6 4. 7. 84 9 7.. 6 Lebih dari. 9 Tabel A.5 Nilai N, n dan c untuk berat bersih lebih dari 4,5 kg ( lb) Ukuran lot (N) Ukuran contoh (n) Jumlah maksimum cacat yang diterima (c) 6 atau kurang 6.. 7. 9 4 7. 5. 48 6 5. 4. 84 9 4. 4. 6 Lebih dari 4. 9 7 dari 8
B. Persiapan contoh Lampiran B (normatif) Cara uji parameter syarat mutu susu bubuk Pengambilan contoh untuk uji mikrobiologi dilakukan pertama, kemudian dilanjutkan dengan pengambilan contoh untuk uji organoleptik dan analisis kimia. Pengambilan contoh diupayakan dari kemasan yang sama. B.. Persiapan contoh untuk uji mikrobiologi Buka kemasan susu bubuk dan ambil contoh susu bubuk sesuai yang diperlukan minimum 4 g secara aseptik dengan menggunakan sendok steril kemudian tempatkan dalam botol contoh. B.. Persiapan contoh untuk uji organoleptik dan analisis kimia Buka kemasan susu bubuk dan ambil contoh susu bubuk sesuai yang diperlukan minimum 4 g secara hati-hati dengan menggunakan sendok yang bersih dan kering kemudian tempatkan dalam botol contoh yang bersih dan kering. B. Keadaan B.. B... Bau Prinsip Melakukan analisis terhadap contoh uji secara organoleptik dengan menggunakan indera penciuman (hidung). B... B... Cara kerja Serbuk susu bubuk a) ambil contoh uji kira-kira 5 g dan letakkan diatas gelas arloji yang bersih dan kering; b) cium contoh uji pada jarak kira-kira ½ cm dari hidung untuk mengetahui baunya; c) lakukan pengerjaan minimal oleh orang panelis atau orang tenaga ahli. B... Larutan susu bubuk a) buat larutan susu bubuk sesuai syarat saji yang tertera pada kemasan di dalam gelas yang bersih dan kering; b) cium contoh uji pada jarak kira-kira ½ cm dari hidung untuk mengetahui baunya; c) lakukan pengerjaan minimal oleh orang panelis atau orang tenaga ahli. 8 dari 8
B... Cara menyatakan hasil a) jika tercium bau khas susu bubuk maka hasil dinyatakan normal ; b) jika tercium bau asing selain bau khas susu bubuk maka hasil dinyatakan tidak normal. B.. B... Rasa Prinsip melakukan analisis terhadap contoh uji secara organoleptik dengan menggunakan indera perasa (lidah). B... B... Cara kerja Serbuk susu bubuk a) ambil kira-kira sendok contoh uji dan rasakan dengan lidah; b) lakukan pengerjaan minimal oleh orang panelis atau orang tenaga ahli. B... Larutan susu bubuk a) buat larutan susu bubuk sesuai syarat saji yang tertera pada kemasan di dalam gelas yang bersih dan kering; b) ambil kira-kira sendok larutan susu bubuk dan rasakan dengan lidah; c) lakukan pengerjaan minimal oleh orang panelis atau orang tenaga ahli. B... Cara menyatakan hasil a) Jika terasa khas susu bubuk maka hasil dinyatakan normal ; b) Jika terasa rasa asing selain rasa khas susu bubuk maka hasil dinyatakan tidak normal. B. Kadar air B. Prinsip Bobot yang hilang selama pemanasan dalam oven pada suhu ( ± ) o C selama jam. Bobot yang hilang atau kadar air dihitung secara gravimetri. B.. Peralatan a) desikator yang berisi desikan; b) botol timbang dengan penutup; c) oven terkalibrasi dengan ketelitian C; d) neraca analitik terkalibrasi dengan ketelitian, mg. B.. Cara kerja a) panaskan botol timbang beserta tutupnya dalam oven pada suhu ( ± ) o C selama lebih kurang satu jam dan dinginkan dalam desikator selama 45 menit kemudian timbang dengan neraca analitik (botol timbang dan tutupnya) (W ); b) masukkan g sampai g contoh ke dalam botol timbang, tutup, dan timbang (W ) ; c) panaskan botol timbang yang berisi contoh tersebut dalam keadaan terbuka dengan meletakkan tutup botol disamping botol di dalam oven pada suhu ( ± ) o C selama dua jam (dua jam setelah suhu oven o C); 9 dari 8
d) tutup botol timbang ketika masih di dalam oven, pindahkan segera kedalam desikator dan dinginkan selama 45 menit kemudian timbang (W ); e) lakukan pekerjaan duplo; f) hitung kadar air dalam contoh. B..4 Perhitungan W W Kadar air = x% W W dengan; W adalah bobot botol timbang kosong dan tutupnya, (g); W adalah bobot botol timbang, tutupnya dan contoh sebelum dikeringkan, (g); W adalah bobot botol timbang, tutupnya dan contoh setelah dikeringkan, (g). B..5 Ketelitian Kisaran hasil dua kali ulangan maksimal 5 % dari nilai rata-rata hasil kadar air atau deviasi (RSD) maksimal %. Jika kisaran lebih besar dari 5 % atau deviasi lebih besar dari % analisis harus diulang kembali. B.4 Lemak B.4. Prinsip Lemak dalam contoh dihidrolisis dengan amonia dan alkohol kemudian diekstraksi dengan eter. Ekstrak eter yang diperoleh kemudian diuapkan sampai kering dalam pinggan alumunium dan kadar lemak dihitung secara gravimetri. B.4. Pereaksi a) air suling; b) amonium hidroksida pekat; c) indikator fenolftalein,5 %; d) etil alkohol 95 %; e) etil eter, bebas peroksida; f) petrolium eter; B.4. Peralatan a) neraca analitik terkalibrasi dengan ketelitian, mg; b) pipet volumetrik 5 ml; c) penangas air; d) labu ekstraksi/ labu Majonnier; e) sentrifus; f) oven terkalibrasi dengan ketelitian o C; g) desikator yang berisi desikan; h) pinggan aluminium atau Labu lemak (Mojonnier); i) gelas ukur. B.4.4 Cara kerja dari 8
a) timbang g contoh susu bubuk ke dalam labu ekstraksi (W), tambahkan ml air suling, aduk sehingga membentuk pasta, dan panaskan jika diperlukan; b) tambahkan ml sampai 5 ml ammonium hidroksida pekat, panaskan dalam penangas air pada suhu 6 o C sampai 7 o C selama 5 menit, sesekali diaduk dan dinginkan; c) tambahkan tetes indikator fenolftalein, ml alkohol 95 %, tutup labu ekstraksi, dan aduk selama 5 detik; d) untuk ekstraksi pertama; tambahkan 5 ml etil eter, tutup labu ekstraksi, dan kocok dengan kencang selama menit e) longgarkan sesekali tutup labu ekstraksi apabila diperlukan. f) tambahkan 5 ml petrolium eter, tutup labu ekstraksi, dan kocok dengan kencang selama menit g) longgarkan sesekali tutup labu ekstraksi apabila diperlukan. h) sentrifuse labu tersebut pada 6 rpm selama detik sehingga terjadi pemisahan fasa air (bright pink) dan eter dengan jelas. i) tuangkan lapisan eter dengan hati-hati kedalam labu lemak atau pinggan alumunium kosong yang telah diketahui bobotnya (W ); j) lapisan air digunakan untuk ekstraksi berikutnya. k) untuk ekstraksi kedua, ulangi cara kerja c j dengan penambahan 5 ml alkohol 95 %, 5 ml etil eter dan 5 ml petrolium eter. l) untuk ekstraksi ketiga, ulangi cara kerja c j dengan tanpa penambahan alkohol 95 %, 5 ml etil eter dan 5 ml petrolium eter (ekstraksi ke- tidak perlu dilakukan untuk susu skim) m) uapkan pelarut diatas penangas air dan keringkan labu lemak/pinggan alumunium yang berisi ekstrak lemak tersebut dalam oven pada suhu ( ± ) o C selama menit atau oven vakum pada suhu 7 o C sampai 75 o C dengan tekanan <5 mf Hg (6,7 Kpa); n) dinginkan dalam desikator dan timbang hingga bobot tetap (W ). B.4.5 Perhitungan W Lemak (%)= W x % W dengan; W adalah bobot contoh, (g); W adalah bobot labu lemak/pinggan alumunium kosong, (g); adalah bobot labu lemak/pinggan alumunium kosong dan lemak, (g). W B.4.6 Ketelitian Kisaran hasil dua kali ulangan maksimal % dari nilai rata-rata hasil lemak atau deviasi (RSD) maksimal 4 %. Jika kisaran lebih besar dari % atau RSD lebih besar dari 4 %, maka analisis harus diulang kembali. B.5 Protein (N 6,8) B.5. Prinsip Contoh uji didestruksi dengan H SO 4 menggunakan CuSO 4.5H O sebagai katalis dan K SO 4 untuk meningkatkan titik didihnya bertujuan melepaskan nitrogen dari protein sebagai garam ammonium. Garam ammonium tersebut diuraikan menjadi NH pada saat destilasi menggunakan NaOH. NH yang dibebaskan diikat dengan asam borat menghasilkan ammonium borat yang secara kuantitatif dititrasi dengan larutan baku asam sehingga diperoleh total nitrogen. Kadar protein susu diperoleh dari hasil kali total nitrogen dengan 6,8. dari 8
B.5. Pereaksi a) asam sulfat, H SO 4 pekat bebas nitrogen; b) larutan katalis tembaga, CuSO 4.5H O bebas nitrogen,5 g/ml H O; c) larutkan 5 g CuSO 4.5H O dengan air suling menjadi ml, lalu pindahkan ke dalam botol bertutup gelas d) katalis selen; e) campurkan 4 g serbuk SeO, 5 g K SO 4 atau Na SO 4 dan g CuSO 4.5 H O f) kalium sulfat, K SO 4 bebas nitrogen; g) batu didih; h) larutan indikator methyl red (MR) / bromocresol green (BCG); i) larutkan, g methyl red dengan etanol 95 % menjadi ml. Larutkan, g bromocresol green dengan etanol 95 % menjadi 5 ml. Campurkan bagian larutan methyl red dan 5 bagian larutan bromocresol green dalam gelas piala lalu pindahkan ke dalam botol bertutup gelas. j) larutan asam borat, H BO 4 %; k) larutkan 4 g H BO dengan air suling menjadi ml dan tambahkan ml larutan indikator methyl red / bromocresol green, aduk, (larutan akan berwarna kuning terang) dan pindahkan ke dalam botol bertutup gelas. l) larutan natrium hidroksida, NaOH %; m) larutkan 6 g hablur NaOH dengan air suling menjadi ml, simpan ke dalam botol bertutup karet. n) larutan indikator fenolftalein (PP) %; o) larutkan g serbuk indikator PP dengan alkohol 95 % dan encerkan menjadi ml. p) larutan asam klorida, HCl,M. q) pipet dengan hati-hati 8,6 ml HCl pekat (6.5 8 %) kedalam labu ukur L dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis dan ditetapkan normalitasnya. B.5. Peralatan a) labu Kjeldahl ml; b) distilator dan kelengkapannya; c) pemanas listrik / alat destruksi dilengkapi dengan penghisap asap; d) neraca analitik terkalibrasi dengan ketelitian, mg; e) buret ml terkalibrasi; f) batu didih. B.5.4 Cara kerja a) timbang g contoh ke dalam labu Kjeldahl, tambahkan 5, g K SO 4, ml larutan katalis CuSO 4.5H O atau g campuran katalis selen, 8- batu didih dan 5 ml H SO 4 pekat; b) panaskan campuran dalam pemanas listrik sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijau-hijauan. Lakukan dalam lemari asam atau lengkapi alat destruksi dengan unit pengisapan asap; c) biarkan dingin, kemudian encerkan dengan air suling secukupnya; d) tambahkan 75 ml larutan NaOH %. (periksa dengan indikator PP sehingga campuran menjadi basa); e) sulingkan selama 5 - menit atau saat larutan destilat telah mencapai kira-kira 5 ml, dengan penampung destilat adalah 5 ml larutan H BO 4 %; f) bilas ujung pendingin dengan air suling; g) titar larutan campuran destilat dengan larutan HCl, M; h) kerjakan penetapan blanko. dari 8
B.5.5 Perhitungan (V V ) x N x 4,8 x % Kadar protein (%) = W dengan: V adalah Volume HCl, N untuk titrasi contoh, (ml); V adalah Volume HCl, N untuk titrasi blanko, (ml); N adalah Normalitas larutan HCl; W adalah bobot contoh (mg); 4,8 adalah bobot atom Nitrogen. 6,8 adalah faktor protein untuk susu. B.5.6 Ketelitian Kisaran hasil dua kali ulangan maksimal 5 % dari nilai rata-rata hasil kadar protein atau deviasi (RSD) maksimal %. Jika kisaran lebih besar dari 5 % atau RSD lebih besar dari % analisis harus diulang kembali. B.6 Cemaran logam B.6. B.6.. Penetapan cemaran logam Cu dan Pb Prinsip Peleburan contoh dengan cara pengabuan kering pada 5 C yang dilanjutkan dengan pelarutan dalam larutan asam. Logam yang terlarut dihitung menggunakan alat Spektrofotometer Serapan Atom (SSA). B.6.. Peralatan a) neraca analitik terkalibrasi dengan ketelitian, mg; b) cawan porselin/platina/kwarsa dengan kapasitas 5 ml ml; c) penangas listrik; d) tanur terkalibrasi dengan ketelitian ºC; e) SSA beserta kelengkapannya (lampu katoda Cu dan Pb) terkalibrasi; f) pipet ukur berskala, kapasitas 5 ml dan ml, g) labu ukur 5 ml, ml, dan ml, terkalibrasi; h) gelas ukur kapasitas ml; i) gelas piala 5 ml; j) penangas air. B.6.. Pereaksi a) larutan asam nitrat, HNO pekat (65 %, Bj,4); b) larutan asam klorida, HCl pekat (7 %, Bj,9) ; c) larutan asam nitrat, HNO, N; d) encerkan 7 ml HNO 65 % dengan air suling dalam labu ukur ml dan encerkan sampai tanda garis. e) larutan asam klorida, HCl 6 N; f) encerkan 5 ml HCl 7 % dengan air suling dalam labu ukur ml dan encerkan sampai tanda garis. g) larutan Mg(NO ). 6H O % dalam alkohol; larutkan g Mg(NO ). 6H O dengan alkohol 95 % menjadi ml. dari 8
h) larutan baku µg/ml Cu; larutkan, g Cu dengan 7 ml HNO pekat dalam gelas piala 5 ml dan masukkan ke dalam labu ukur ml kemudian encerkan dengan air suling sampai tanda garis. Alternatif lain, bisa digunakan larutan baku Cu µg/ml siap pakai. i) larutan baku µg/ml Cu; pipet ml larutan baku µg/ml Cu ke dalam labu ukur 5 ml kemudian encerkan dengan air suling sampai tanda garis kemudian dikocok. Larutan baku kedua ini memiliki konsentrasi µg/ml Cu. j) larutan baku µg/ml Cu; pipet ml larutan baku µg/ml Cu ke dalam labu ukur ml kemudian encerkan dengan air suling sampai tanda garis kemudian dikocok. Larutan baku ketiga ini memiliki konsentrasi µg/ml Cu. k) larutan baku kerja Cu; pipet ke dalam labu ukur ml masing-masing sebanyak ml; ml; ml; 4 ml; 7 ml dan 9 ml larutan baku µg/ml kemudian tambahkan 5 ml larutan HNO N atau HCl 6 N dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis kemudian kocok. Larutan baku kerja ini memiliki konsentrasi µg/ml;, µg/ml;,4 µg/ml;,8 µg/ml;,4 µg/ml dan,8 µg/ml Cu. l) larutan baku µg/ml Pb; larutkan, g Pb dengan 7 ml HNO pekat dalam gelas piala 5 ml dan masukkan ke dalam labu ukur ml, kemudian encerkan dengan air suling sampai tanda garis kemudian kocok. Alternatif lain, bisa digunakan larutan baku Pb µg/ml siap pakai. m) larutan baku 5 µg/ml Pb; pipet 5, ml larutan baku µg/ml Pb ke dalam labu ukur ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis kemudian kocok. Larutan baku kedua ini memiliki konsentrasi Pb 5 µg/ml. n) larutan baku kerja Pb; pipet ke dalam labu ukur ml masing-masing sebanyak ml,,5 ml; ml; ml; ml dan 4 ml larutan baku 5 µg/ml kemudian tambahkan 5 ml larutan HNO N atau HCl 6 N, dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis kemudian kocok. Larutan baku kerja ini memiliki konsentrasi µg/ml;,5 µg/ml;,5 µg/ml;, µg/ml;,5 µg/ml dan, µg/ml Pb. B.6..4 Cara kerja a) timbang dengan teliti 5 g contoh dalam cawan porselin/platina/kuarsa (m); b) tempatkan cawan berisi contoh uji di atas penangas listrik dan panaskan secara bertahap sampai contoh uji terbakar dan tidak berasap lagi; (bisa ditambahkan ml MgNO. 6H O % dalam alkohol untuk mempercepat pengabuan) c) lanjutkan pengabuan dalam tanur 5 C sampai abu berwarna putih, bebas dari karbon; d) apabila abu belum bebas dari karbon yang ditandai dengan warna keabu-abuan, basahkan dengan beberapa tetes air dan tambahkan tetes demi tetes HNO pekat kirakira,5 ml sampai dengan ml; e) keringkan cawan di atas penangas listrik dan masukkan kembali ke dalam tanur pada suhu 5 C kemudian lanjutkan pemanasan sampai abu menjadi putih. Penambahan HNO pekat bisa diulangi apabila abu masih berwarna keabu-abuan; f) larutkan abu berwarna putih dalam 5 ml HCl 6 N atau 5 ml HNO N sambil dipanaskan di atas penangas listrik atau penangas air selama menit sampai menit dan masukkan ke dalam labu ukur 5 ml kemudian tepatkan hingga tanda garis dengan air suling (V); g) jika perlu, saring larutan menggunakan kertas saring Whatman No.4 ke dalam labu ukur 5 ml; h) siapkan larutan blanko dengan penambahan pereaksi dan perlakuan yang sama seperti contoh; 4 dari 8
i) baca absorbans larutan baku kerja dan larutan contoh terhadap blanko menggunakan SSA pada panjang gelombang maksimum sekitar 4 nm untuk Cu dan 8 nm untuk Pb); j) buat kurva kalibrasi antara konsentrasi logam (µg/ml) sebagai sumbu X dan absorbans sebagai sumbu Y; k) plot hasil pembacaan larutan contoh terhadap kurva kalibrasi; l) hitung kandungan logam dalam contoh. B.6..5 Perhitungan C Kandungan logam (mg/kg) = x V m dengan: C adalah konsentrasi logam dari kurva kalibrasi, (µg/ml); V adalah volume larutan akhir, (ml); m Adalah bobot contoh, (g). B.6..6 Ketelitian Kisaran hasil dua kali ulangan deviasi (RSD) maksimal %. Jika RSD lebih besar dari % maka analisis harus diulang. B.6. B.6.. Penetapan timah (Sn) Prinsip Contoh didekstruksi dengan HNO dan HCl kemudian ditambahkan KCl untuk mengurangi gangguan. Sn dibaca menggunakan spektrofotometer serapan atom pada panjang gelombang maksimum 5,5 nm dengan nyala oksidasi N O-C H. B.6.. Pereaksi a) larutan kalium, mg/ml K; larutkan,9 g KCl dengan air menjadi ml. b) asam nitrat pekat, HNO pekat; c) asam klorida pekat, HCl pekat; d) larutan baku mg/l Sn; larutkan, g Sn dengan ml asam HCl pekat dalam labu ukur ml, tambahkan ml air suling, dinginkan pada suhu ruang dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis. e) larutan baku kerja Sn. pipet ml HCl pekat dan, ml larutan KCl ke dalam masing-masing labu ukur ml. Tambahkan masing-masing ;,5 ml;, ml;,5 ml;, ml dan,5 ml larutan baku mg/l Sn dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis. Larutan baku kerja ini memiliki konsentrasi µg/ml; 5 µg/ml; µg/ml; 5 µg/ml; µg/ml dan 5 µg/ml Sn. B.6.. Peralatan a) neraca analitik terkalibrasi dengan ketelitian, mg; b) erlenmeyer 5 ml; c) penangas listrik; d) tanur terkalibrasi dengan ketelitian o C; e) SSA beserta kelengkapannya (lampu katoda Sn) terkalibrasi; f) pipet ukur berskala, kapasitas 5 ml dan ml terkalibrasi; 5 dari 8
g) labu ukur 5 ml, ml, dan ml, terkalibrasi; h) gelas ukur kapasitas 5 ml; i) gelas piala 5 ml; j) penangas air. B.6..4 Cara kerja a) timbang 5g sampai g contoh ke dalam erlemeyer 5 ml, tambahkan ml HNO pekat, dan biarkan 5 menit; b) panaskan perlahan, hindari terjadinya percikan yang berlebihan; c) lanjutkan pemanasan sampai sisa volume ml sampai 6 ml atau sampai contoh mulai kering pada bagian bawahnya, hindari terbentuknya arang. d) angkat erlenmeyer dari penangas listrik, tambahkan 5 ml HCl pekat, dan panaskan sampai selama 5 menit sampai letupan dari uap Cl berhenti. e) tingkatkan pemanasan dan didihkan sehingga sisa volume ml sampai 5 ml. f) tambahkan 4 ml air sulung, aduk, dan tuangkan ke dalam labu ukur ml, bilas erlenmeyer tersebut dengan ml air suling; g) tambahkan, ml KCl, dinginkan pada temperatur ruang, tera dengan air suling, dan saring. h) siapkan larutan blanko dengan penambahan pereaksi dan perlakuan yang sama seperti contoh; i) baca absorbans larutan baku kerja dan larutan contoh terhadap blanko menggunakan SSA pada panjang gelombang maksimum 5,5 nm dengan nyala oksidasi N O-C H ; j) buat kurva kalibrasi antara konsentrasi logam (µg/ml) sebagai sumbu X dan absorbans sebagai sumbu Y; k) plot hasil pembacaan larutan contoh terhadap kurva kalibrasi; l) hitung kandungan logam dalam contoh. B.6..5 Perhitungan Kandungan Sn (mg/kg) = C m x V dengan: C adalah konsentrasi logam dari kurva kalibrasi, (µg/ml) V adalah volume larutan akhir, (ml); m adalah bobot contoh, (g). B.6..6 Ketelitian Kisaran hasil dua kali ulangan deviasi (RSD) maksimal %. Jika RSD lebih besar dari %, maka analisis harus diulang kembali. B.6. B.6.. Penetapan raksa (Hg) Prinsip Reaksi antara senyawa raksa dengan NaBH 4 atau SnCl dalam keadaan asam akan membentuk gas atomik Hg. Jumlah Hg yang terbentuk sebanding dengan absorbans Hg yang dibaca menggunakan spektrofotometer serapan atom tanpa nyala pada panjang gelombang maksimum 5,7 nm. 6 dari 8
B.6.. Pereaksi a) asam sulfat, H SO 4 8 N; b) asam nitrat, HNO 7 N; c) batu didih; d) campuran HNO : HClO 4 (:); e) hidrogen peroksida, H O ; f) larutan molibdat %. g) larutan pereduksi; h) campurkan 5 ml H SO 4 dengan ml air suling dalam gelas piala 5 ml dan dinginkan sampai suhu ruang kemudian tambahkan 5 g NaCl, 5 g hidroksilamin sulfat, dan 5 g SnCl. Pindahkan kedalam labu ukur 5 ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis. i) larutan NaBH 4 ; j) larutkan g serbuk NaBH 4 dan g NaOH dengan air suling dalam labu ukur 5 ml. k) larutan pengencer; l) masukkan ml sampai 5 ml air suling kedalam labu ukur ml dan tambahkan 58 ml HNO kemudian 67 ml H SO 4. Encerkan dengan air suling sampai tanda garis dan kocok. m) larutan baku µg/ml Hg; n) larutkan,54 g HgCl dengan kira-kira 5 ml air suling dalam gelas piala 5 ml dan masukkan ke dalam labu ukur ml kemudian encerkan dengan air suling sampai tanda garis. o) larutan baku µg/ml Hg; p) pipet ml larutan baku µg/ml Hg ke dalam labu ukur ml dan encerkan dengan larutan pengencer sampai tanda garis kemudian kocok. Larutan baku kedua ini memiliki konsentrasi µg /ml. q) larutan baku kerja Hg; pipet masing-masing,5 ml;,5 ml; ml; dan ml larutan baku mg/l ke dalam labu ukur ml terpisah dan encerkan dengan larutan pengencer sampai tanda garis. Larutan baku kerja ini memiliki konsentrasi,5 µg/ml;,5 µg/ml;, µg/ml; dan, µg/ml Hg. B.6.. Peralatan a) spektrofotometer serapan atom yang dilengkapi lampu katoda Hg dan generator uap hidrida ( HVG ); b) neraca analitik terkalibrasi dengan ketelitian, mg; c) labu destruksi 5 ml berdasar bulat; d) pendingin terbuat dari borosilikat, diameter mm 8 mm, tinggi 4 mm diisi dengan cincin Raschig setinggi mm, dan dilapisi dengan batu didih berdiameter 4 mm di atas cincin setinggi mm; e) labu ukur ml, 5 ml, dan ml terkalibrasi; f) penangas listrik; g) gelas ukur 5 ml; h) pipet ukur berskala,5 atau mikroburet terkalibrasi B.6..4 Cara kerja B.6..4. Pengabuan basah a) timbang 5 g contoh ke dalam labu destruksi dan tambahkan 5 ml H SO 4 8 N, ml HNO 7 N, ml larutan Natrium molibdat %, dan 5 batu didih sampai 6 batu didih; b) hubungkan labu destruksi dengan pendingin dan panaskan di atas penangas listrik selama jam. Hentikan pemanasan dan biarkan selama 5 menit; 7 dari 8
c) tambahkan ml HNO HClO 4 (:) melalui pendingin; d) hentikan aliran air pada pendingin dan panaskan dengan panas tinggi hingga timbul uap putih. Lanjutkan pemanasan selama menit dan dinginkan; e) tambahkan ml air melalui pendingin dengan hati-hati sambil labu digoyanggoyangkan; f) didihkan lagi selama menit; g) matikan pemanas dan cuci pendingin dengan 5 ml air suling sebanyak kali kemudian dinginkan sampai suhu kamar; h) pindahkan larutan destruksi contoh ke dalam labu ukur ml secara kuantitatif dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis; i) siapkan larutan blanko dengan penambahan pereaksi dan perlakuan yang sama seperti contoh; j) tambahkan larutan pereduksi ke dalam larutan baku kerja Hg, larutan contoh, dan larutan blanko pada alat HVG ; k) baca absorbans larutan baku kerja, larutan contoh, dan larutan blanko menggunakan SSA tanpa nyala pada panjang gelombang 5,7 nm; l) buat kurva kalibrasi antara konsentrasi logam (µg/ml) sebagai sumbu X dan absorbans sebagai sumbu Y; m) plot hasil pembacaan larutan contoh terhadap kurva kalibrasi; n) hitung kandungan Hg dalam contoh; B.6..4. Destruksi menggunakan digester microwave dengan sistim tertutup a) timbang g contoh ke dalam tabung destruksi dan tambahkan ml HNO, ml H O kemudian tutup rapat. b) masukkan ke dalam oven microwave dan kerjakan sesuai dengan petunjuk pemakaian alat; c) pindahkan larutan destruksi contoh ke dalam labu ukur 5 ml secara kuantitatif dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis; d) siapkan larutan blanko dengan penambahan pereaksi dan perlakuan yang sama seperti contoh; e) tambahkan larutan pereduksi ke dalam larutan baku kerja, larutan contoh, dan larutan blanko pada alat HVG ; f) baca absorbans larutan baku kerja, larutan contoh, dan larutan blanko menggunakan SSA tanpa nyala pada panjang gelombang 5,7 nm; g) buat kurva kalibrasi antara konsentrasi logam (µg/ml) sebagai sumbu X dan absorbans sebagai sumbu Y; h) plot hasil pembacaan larutan contoh terhadap kurva kalibrasi; i) hitung kandungan Hg dalam contoh; B.6..5 Perhitungan C Kandungan Hg (mg/kg) = x V m dengan: C adalah konsentrasi logam dari kurva kalibrasi, (µg/ml) V adalah volume larutan akhir, (ml); m adalah bobot contoh, (g). B.6..6 Ketelitian Kisaran hasil dua kali ulangan deviasi(rsd) maksimal 6%. Jika RSD lebih besar dari 6%, maka analisis harus diulang kembali. 8 dari 8
B.7 Cemaran arsen (As) B.7. Prinsip Contoh didestruksi dengan asam menjadi larutan arsen. Larutan As 5+ direduksi dengan KI menjadi As + dan direaksikan dengan NaBH 4 atau SnCl sehingga terbentuk AsH yang kemudian dibaca dengan SSA pada panjang gelombang 9,7 nm. B.7. Peralatan a) spektrofotometer serapan atom yang dilengkapi dengan lampu katoda As dan generator uap hidrida ( HVG ); b) neraca analitik terkalibrasi dengan ketelitian, mg c) labu Kjeldahl 5 ml; d) labu ukur 5 ml, ml, 5 ml, dan ml terkalibrasi; e) pemanas listrik; f) pipet volumetrik 5 ml; g) cawan porselen kapasitas 5 ml. h) gelas ukur 5 ml i) tanur terkalibrasi debngan ketelitian o C; j) pipet ukur berskala,5 ml atau mikroburet terkalibrasi B.7. Pereaksi a) asam nitrat, HNO pekat; b) asam perklorat, HClO 4 pekat c) natrium boronhidrida, NaBH 4 ; d) larutkan g NaBH 4 dan g NaOH dengan air suling sampai tanda garis dalam labu ukur 5 ml. e) asam klorida, HCl 8 M; f) larutkan 66 ml HCl 7 % kedalam labu ukur ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis. g) timah (II) klorida, SnCl.H O %; h) timbang 5 g SnCl.H O ke dalam piala gelas ml dan tambahkan ml HCl 7 %. Panaskan hingga larutan jernih dan dinginkan kemudian tuangkan ke dalam labu ukur 5 ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis. i) kalium iodida, KI %; j) timbang g KI ke dalam labu ukur ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis (larutan harus dibuat langsung sebelum digunakan). k) larutan baku µg/ml As; l) larutkan, g As O kering dengan sedikit NaOH % dan netralkan dengan HCl atau HNO : ( bagian asam : bagian air). Masukkan ke dalam labu ukur liter dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis. m) larutan baku µg/ml As; n) pipet ml larutan baku arsen µg/ml ke dalam labu ukur ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis. Larutan baku kedua ini memiliki konsentrasi µg/ml As. o) larutan baku µg/ml As; p) pipet ml larutan standar arsen mg/l ke dalam labu ukur ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis. Larutan baku ketiga ini memiliki konsentrasi µg/ml As. q) larutan baku kerja As; pipet masing-masing, ml;, ml;, ml; 4, ml dan 5, ml larutan baku µg/ml As ke dalam labu ukur ml terpisah dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis 9 dari 8
B.7.4 kemudian kocok Larutan baku kerja ini memiliki konsentrasi, µg/ml;, µg/ml;, µg/ml;,4 µg/ml dan,5 µg/ml As. B.7.4. Persiapan contoh Pengabuan basah a) timbang 5 g contoh dalam labu Kjeldahl dan tambahkan ml H SO 4 pekat dan 5 ml HNO pekat; b) setelah reaksi selesai, panaskan dan tambahkan HNO pekat sedikit demi sedikit sehingga contoh berwarna coklat atau kehitaman; c) tambahkan ml HClO 4 sedikit demi sedikit dan panaskan lagi sehingga larutan menjadi jernih atau berwarna kuning (jika terjadi pengarangan setelah penambahan asam perklorat, tambahkan lagi sedikit HNO pekat; d) pindahkan secara kuantitatif ke dalam labu ukur 5 ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis; B.7.4. Pengabuan kering a) timbang 5 g contoh dalam cawan dan tambahkan,5 g Mg(NO ).6H O dan 5 ml HNO pekat; b) aduk dengan sempurna dan uapkan di atas penangas listrik hingga kering dan arangkan; c) abukan dalam tanur 5 C selama jam, dinginkan dan basahkan dengan HNO pekat. Uapkan lagi dan abukan lagi selama jam pada 5 C sampai didapat abu berwarna putih; d) larutkan dengan larutan HCl : dalam labu ukur 5 ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis; B.7.4. Destruksi dengan microwave (sistem tertutup) a) timbang g contoh ke dalam tabung destruksi dan tambahkan ml HNO, ml H O kemudian tutup rapat. b) masukkan ke dalam oven microwave dan kerjakan sesuai dengan petunjuk pemakaian alat; c) setelah dingin, pindahkan larutan destruksi ke dalam labu ukur 5 ml secara kuantitatif dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis; B.7.5 Cara kerja a) siapkan NaBH 4 dan HCl dalam tempat yang sesuai dengan yang ditentukan oleh alat; b) pipet 5 ml larutan destruksi dan tambahkan ml HCl 8 M,, ml KI % kemudian kocok dan biarkan minimal menit; c) tuangkan larutan tersebut ke dalam tabung contoh pada alat; d) tuangkan larutan baku kerja As, µg/ml;, µg/ml;, µg/ml;,4 µg/ml;,5 µg/ml serta blanko ke dalam 6 tabung contoh lainnya. Nyalakan burner serta tombol pengatur aliran pereaksi dan aliran contoh; e) baca nilai absorbans tertinggi larutan baku kerja As dan contoh dengan blanko sebagai koreksi; f) buat kurva kalibrasi antara konsentrasi As (µg/ml) sebagai sumbu X dan absorbans sebagai sumbu Y; g) plot hasil pembacaan larutan contoh terhadap kurva kalibrasi; h) hitung kandungan As dalam contoh. dari 8
B.7.6 Perhitungan Kandungan arsen (mg/kg) = C m dengan: C adalah konsentrasi logam dari kurva kalibrasi, (µg/ml) V adalah volume larutan akhir, (ml); m adalah bobot contoh, (g). B.7.7 Ketelitian xv Kisaran hasil dua kali ulangan deviasi(rsd) maksimal 6%. Jika RSD lebih besar dari 6%, maka analisis harus diulang kembali. B.8 Cemaran mikroba B.8. Persiapan dan homogenisasi contoh untuk uji Angka Lempeng Total, Bakteri coliform, Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus B.8.. Prinsip Pembebasan sel-sel bakteri yang mungkin terlindung oleh partikel makanan dan untuk menggiatkan kembali sel-sel bakteri yang mungkin viabilitasnya berkurang karena kondisi yang kurang menguntungkan dalam makanan. Persiapan dan homogenisasi contoh bertujuan agar bakteri terdistribusi dengan baik di dalam contoh makanan yang ditetapkan. B.8.. Larutan Pengencer a) Buffered Pepton Water (BPW) b) Pepton g c) Natrium klorida 5 g d) Disodium hydrogen phosphate,5 g e) Kalium dihydrogen phosphate,5 g f) Air suling ml g) Larutkan bahan-bahan diatas menjadi ml dengan air suling dan atur ph menjadi 7,. Pipet 5 ml atau 45 ml larutan tersebut ke dalam botol 5 ml dan 9 ml ke dalam tabung reaksi. Sterilkan menggunakan autoklaf pada suhu C selama menit. B.8.. Peralatan a) neraca analitik terkalibrasi dengan ketelitian, g; b) gelas piala steril; c) labu erlenmeyer steril; d) botol pengencer steril; e) pipet volumetrik steril; f) tabung reaksi; g) alat pembuka kemasan steril; h) pisau, sendok, gunting, dan spatula steril; i) labu ukur 5 ml, ml, 5 ml, dan ml terkalibrasi; j) penangas listrik. dari 8
B.8..4 Cara kerja a) timbang 5 g contoh dan masukkan ke dalam erlenmeyer yang telah berisi 5 ml larutan pengencer sehingga diperoleh pengenceran :. b) kocok campuran beberapa kali sehingga homogen. B.8. B.8.. Angka lempeng total (metode plate count) Prinsip Pertumbuhan bakteri mesofil aerob setelah contoh diinkubasikan dalam pembenihan yang sesuai selama 4 jam sampai 48 jam pada suhu (5 ± ) C. B.8.. Peralatan a) cawan petri gelas / plastik diameter 9 mm mm steril; b) pipet ukur ml, 5 ml, dan ml; c) penangas air; d) lemari pengeram (inkubator); e) alat penghitung koloni (colony counter); f) autoclave: g) oven/alat sterilisasi kering. B.8.. Pembenihan dan pengencer a. Plate count agar (PCA) - Pancreatic digest of Caseine 5 g - Yeast extract,5 g - Glukosa g - Agar 5 g - Air suling ml Larutkan bahan-bahan diatas menjadi ml dengan air suling dan atur ph menjadi 7,. Masukkan ke dalam botol ml dan 9 ml ke dalam tabung reaksi. Sterilkan menggunakan autoklaf pada suhu C selama 5 menit b. Buffered peptone water (BPW) - Peptone g - Natrium klorida 5 g - Disodium hidrogen fosfat,5 g - Kalium dihidrogen fosfat,5 g - Air suling ml Larutkan bahan-bahan diatas menjadi ml dengan air suling dan atur ph menjadi 7,. Pipet 5 ml atau 45 ml larutan tersebut ke dalam botol 5 ml dan 9 ml ke dalam tabung reaksi. Sterilkan menggunakan autoklaf pada suhu C selama menit. B.8..4 Cara kerja a) Buat tingkat pengenceran sesuai kebutuhan seperti pada Gambar dengan menggunakan larutan pengencer Buffered peptone water; dari 8
Gambar B. Metoda pengenceran b) Pipet masing-masing ml dari pengenceran sampai 4 ke dalam cawan petri steril secara duplo; c) Tuangkan ml sampai 5 ml media PCA yang masih cair dengan suhu (45 ± ) C ke dalam masing-masing cawan petri.; d) Goyangkan cawan petri dengan hati-hati (putar dan goyang ke depan, ke belakang, ke kanan dan ke kiri) sehingga contoh dan pembenihan tercampur merata dan memadat; e) Kerjakan pemeriksaan blanko dengan mencampur air pengencer untuk setiap contoh yang diperiksa; f) Biarkan sampai campuran dalam cawan petri memadat; g) Masukkan semua cawan petri dengan posisi terbalik ke dalam lemari pengeram pada suhu (5 ± ) C selama 4 jam sampai 48 jam; h) Catat pertumbuhan koloni pada setiap cawan petri yang mengandung 5 koloni sampai 5 koloni setelah 48 jam; B.8..5 Perhitungan Angka lempeng total ( koloni/g) = n x F Dengan: n adalah rata rata koloni dari dua cawan petri dari satu pengenceran, (koloni/g); F adalah faktor pengenceran dari rata-rata koloni yang dipakai. B.8..6 Pernyataan hasil B.8..6. Cara menghitung a) Pilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 5 koloni sampai 5 koloni setiap cawan petri. Hitung semua koloni dalam cawan petri dari 8
menggunakan alat penghitung koloni. Hitung rata-rata jumlah koloni dan kalikan dengan faktor pengenceran. Nyatakan hasilnya sebagai jumlah bakteri per gram. b) Jika salah satu dari dua cawan petri terdapat jumlah koloni lebih kecil dari 5 koloni atau lebih besar dari 5 koloni, hitung jumlah koloni yang terletak antara 5 koloni sampai 5 koloni dan kalikan dengan faktor pengenceran. Nyatakan hasilnya sebagai jumlah bakteri per gram. Contoh : - - 5 5 ALT = + 5 + 5 x +, x x = 4,975 [( ) ( ) ] c) Jika hasil dari dua pengenceran jumlahnya berturut-turut terletak antara 5 koloni sampai 5 koloni, hitung jumlah koloni dari masing-masing pengenceran koloni per g dengan rumus : C ALT = [( x n) + (, x n ) x d] dengan : C adalah jumlah koloni dari tiap-tiap petri; n adalah jumlah petri dari pengenceran pertama yang dihitung; n adalah jumlah petri dari pengenceran kedua; d adalah pengenceran pertama yang dihitung; Contoh : - - 4 5 ALT = + 4 + + 5 x +, x x = [( ) ( ) ] 64,57 d) Jika jumlah koloni dari masing-masing petri lebih dari 5 koloni nyatakan sebagai jumlah bakteri perkiraan. - Jika jumlah koloni per cm kurang dari koloni maka nyatakan hasilnya sebagai jumlah perkiraan : jumlah bakteri dikalikan faktor pengenceran. Contoh : - - Jumlah bakteri perkiraan ~ 64 x 64 = 64. (6.4 x 5 ) - Jika jumlah koloni per cm lebih dari koloni maka nyatakan hasilnya: area x faktor pengenceran x contoh rata-rata jumlah koloni per cm Contoh : - - area (cm ) jumlah bakteri perkiraan ~ 75 65 > 65 x x = > 65. (6.5 x 6 ) ~ 649 59 > 59 x x = > 59. (5.9 x 6 ) e) Jika jumlah koloni dari masing-masing koloni yang tumbuh pada cawan petri kurang dari 5 maka nyatakan jumlah bakteri perkiraan lebih kecil dari 5 koloni dikalikan pengenceran yang terendah. 4 dari 8
f) Menghitung koloni perambat. Perambatan pada koloni ada macam, yaitu : - Merupakan rantai yang tidak terpisah; - Perambat yang terjadi diantara dasar cawan petri dan pembenihan; - Perambatan yang terjadi pada pinggir atau penukaran pembenihan. Jika terjadi hanya satu perambatan (seperti rantai) maka koloni dianggap satu. Jika terbentuk satu atau lebih rantai terbentuk dan berasal dari sumber yang terpisah-pisah, maka uap sumber dihitung sebagai satu koloni. B.8..6. Cara menghitung dan membulatkan angka Dalam melaporkan jumlah koloni atau jumlah koloni perkiraan hanya angka penting yang digunakan, yaitu angka pertama dan kedua (dimulai dari kiri), a) Jika angka ketiga lebih besar dari 5 maka bulatkan ke atas. contohnya : 58 dilaporkan sebagai 5 penulisannya 5, x b) Jika angka ketiga kurang dari 5 maka bulatkan kebawah. contohnya : 5 dilaporkan sebagai 5 penulisannya 5, x c) Jika angka ketiga sama dengan 5 maka bulatkan sebagai berikut : - Bulatkan ke atas jika angka kedua merupakan angka ganjil. contohnya : 575 dilaporkan sebagai 58 penulisannya 5,8 x - Bulatkan ke bawah jika angka kedua merupakan angka genap contohnya: 565 dilaporkan sebagai 56 penulisannya 5,6 x B.8. B.8.. Bakteri coliform dan Escherichia coli Prinsip Pertumbuhan bakteri coliform ditandai dengan terbentuknya gas pada tabung durham, yang diikuti dengan uji biokimia dan selanjutnya dirujuk pada Tabel APM (Angka Paling Mungkin). B.8.. Peralatan a) cawan petri gelas ukuran 5 mm x mm atau plastik ukuran 5 mm x 9 mm, steril; b) pipet Mohr ml dan ml berskala; c) botol pengenceran (± ml) gelas borosilikat yang resistan, dengan sumbat karet atau tutup uliran; d) lemari pengeram (Inkubator), (5 ± ) C; e) tabung reaksi dan tabung Durham; f) rak untuk tabung reaksi; g) jarum inokulasi (ose), dengan diameter dalam kira-kira mm; h) penangas air tertutup dengan sistem sirkulasi, (45,5 ±,) C. B.8.. Perbenihan pengencer dan pereaksi a) lauryl sulfate tryptose (LST) broth / Lauryl tryptose (LST) broth; b) brilliant green lactose bile (BGLB) broth %; c) E. C. Broth; d) levine's Eosin methylene blue (L-EMB) agar; e) plate Count Agar (PCA); f) gram stain; g) tryptone (tryptophane) broth; h) pereaksi Kovacs ; 5 dari 8
i) MR - VP broth; j) pereaksi Voges Proskauer; k) larutan Methyl Red; l) koser's Citrate Medium; m) bacto Peptone Water 9 ml dalam tabung-tabung steril; n) pereaksi Indole; o) parutan Kalium Hidroksida 4 %; p) nafto/l; q) preatin. B.8..4 B.8..4. Cara kerja Presumptive test untuk Bakteri coliform (Uji Dugaan) a) Lakukan persiapan dan homogenisasi contoh seperti pada B.8..4. b) Inokulasikan masing-masing ml larutan dari setiap tingkat pengenceran ( -, - dan - ) ke dalam tiga tabung Laurryl sulfate broth. Pegang pipet sedemikian sehingga ujung bawah pipet menempel pada tabung. Biarkan isi pipet mengalir detik sampai detik. Pipet jangan ditiup untuk mengeluarkan isinya; c) Masukkan tabung-tabung tersebut ke dalam inkubator pada suhu 5 o C selama (48 ± ) jam; d) Amati tabung-tabung tersebut pada pada jam ke-(4 ± ) jika ada tabung yang telah mengandung gas, maka tabung tersebut dinyatakan positif ; e) Tabung-tabung yang belum mengandung gas dinyatakan negatif, lanjutkan inkubasi selama 4 jam; f) Catat adanya pembentukan gas dalam jumlah berapapun, setelah inkubasi (48 ± ) jam, karena ini adalah presumptive test yang positif untuk bakteri coliform untuk tabungtabung yang negatif; g) Lakukan confirmed test terhadap semua tabung yang positif untuk presumptive test. B.8..4. Confirmed Test untuk Bakteri coliform (Uji Penegasan) a) Kocok Tabung LST yang positif secara hati-hati dengan cara memutar-mutar tabung; b) Pindahkan satu mata Ose dari setiap tabung LST yang positif ke dalam tabung BGLB % yang berlainan; c) Masukkan tabung-tabung BGLB % kedalam inkubator pada suhu (5 ± ) C selama (48 ± ) jam; d) Catat semua tabung BGLB yang positif menghasilkan gas dan dengan menggunakan tabel Angka Paling Mungkin (APM) Tabel., tentukan APM berdasarkan jumlah tabung BGLB yang memperlihatkan pembentukan gas dalam jumlah berapapun, selama (48 ± ) jam pada (5 ± ) C; e) Laporkan sebagai APM bakteri coliform per gram. B.8..4. Confirmed Test untuk uji Escherichia coli a) Kocok Tabung LST yang positif secara hati-hati dengan cara memutar-mutar tabung; b) Pindahkan satu mata Ose dari setiap tabung LST yang positif ke dalam tabung EC broth yang berlainan; c) Inkubasikan tabung-tabung EC tersebut ke dalam penangas air yang bersikulasi, selama (48 ± ) jam pada (45,5 ±,) C. Penangas air dipertahankan supaya tetap bersih, tertutup dan dengan tinggi permukaan air di atas permukaan tertinggi media dalam tabung.; d) Periksa tabung EC tersebut pada jam ke-(48 ± ) jika telah terbentuk gas dalam jumlah berapapun maka tabung tersebut dinyatakan "positif ; e) Kocok tabung-tabung EC yang positif secara hati-hati; 6 dari 8
f) Digoreskan/ditanamkan pada satu cawan agar L-EMB, sedemikian rupa hingga dihasilkan koloni yang terpisah-pisah dengan jarak minimum,5 cm g) Inkubasikan pinggan L-EMB tersebut selama 8 jam sampai 4 jam pada (5 ± ) C; h) Periksa pinggan - pinggan terhadap adanya koloni yang berwarna coklat dengan atau tanpa kilat logam; i) Dari tiap pinggan L - EMB, ambil dengan jarum, paling sedikit koloni yang mencurigakan yang letaknya terpisah dan pindahkan pada tabung agar miring PCA untuk digunakan sebagai inokulum pada uji biokimia; j) Tabung-tabung agar miring dari koloni yang dicurigai ini diinkubasikan selama 8 jam sampai 4 jam pada 5 C. Buatlah pewarnaan Gram dari tiap biakan, E coli adalah Gram negatif dan berbentuk batang tak berspora; k) Uji sifat - sifat biokimia dengan menggunakan reaksi-reaksi IMVIC. B.8..5 Pembentukan indol - Inokulasi tabung tryptone broth. - Inkubasi selama (4 ± ) jam pada 5 C. - Uji adanya indol dengan menambahkan, ml sampai, ml pereaksi Kovacs. - Uji ini positif bila lapisan atas berwarna merah. Reaksi Voges Proskauer dan Methyl red - Inokulasi tabung medium MR - VP dari setiap tabung PCA dan inkubasikan selama (48 ± ) jam pada 5 C. - Secara aseptis pindahkan ml biakan tabung reaksi steril. - Tambahkan,6 ml larutan 5 % alfa naftol dalam alkohol,, ml larutan KOH 4 % dan beberapa butir kristal kreatin. - Uji Voges Proskauer adalah positif bila terbentuk warna eosin merah muda dalam waktu jam. - Tabung medium MR - VP yang semula, diinkubasikan kembali selama 48 jam pada 5 C. - Tambahkan 5 tetes indikator methyl red pada setiap tabung. - Biakan dianggap MR positif bila terjadi warna merah, MR negatif bila kuning. Penggunaan Sitrat - Dengan hati - hati tabung Koser's citrate medium diinokulasi dengan menggunakan jarum lurus sedemikian rupa sehingga hanya mengenai permukaan medium. Terlalu banyak inokulasi dapat menyebabkan terbawanya zat - zat lain. - Inkubasikan selama 96 jam pada suhu 5 C. - Adanya pertumbuhan dalam tabung menandakan uji yang positif (perubahan warna dari hijau ke biru). Pembentukan gas dari Lactose - Inokulasikan tabung kaldu LST dari setiap agar miring PCA. Inkubasikan selama (48 ± ) jam pada suhu 5 C. - Periksa tabung tabung itu terhadap adanya pembentukan gas. Klasifikasi dan laporan Tabel B. Reaksi biokimia E. coli pada uji IMVIC Escherichia Coli Varitas I Varitas II Jasad Indol Methyl Red Voges Proskaeur Citrate + - + + - - - - 7 dari 8