Bab III Metodologi Penelitian 3.1 Bahan Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah karotenoid yang diisolasi dari wortel (Daucus carota) dan tomat (Lycopersican esculentum). Bahan yang digunakan antara lain madu, aseton, metanol, dietil eter, heksana dan gas nitrogen. 3.2 Metode Ekstraksi Karotenoid pada Wortel dan Tomat Sebanyak 0.25 kg sampel wortel dan tomat, masing-masing dibersihkan dari kotoran kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender dan ditambahkan CaCO3 sebagai agen penetral. Pelarut yang digunakan adalah aseton : metanol dengan perbandingan 7 : 3 v/v. Sampel kemudian diaduk selama beberapa menit sampai pigmen terangkat kemudian disaring. Hasil penyaringan kemudian dipartisi dengan dietil eter dan campuran air dan NaCl pekat. Hipofase (air dan pelarut) kemudian dibuang dan epifase (pigmen) ditampung. Epifase kemudian kemudian ditambah dengan Na2SO4 anhidrat, disaring kemudian diuapkan. Ekstrak yang diperoleh disimpan dalam botol sampel dan dikeringkan menggunakan N2. 18
3.2.1 Kromatografi Kolom Pigmen yang diperoleh dari hasil ekstraksi kemudian diproses ke tahap berikutnya. Kromatografi kolom bertujuan untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan rambat antar komponen dalam suatu medium tertentu. Pelarut yang digunakan adalah heksan, eter dan aseton dengan perbandingan 6 : 3 : 2. Fase diam yang digunakan adalah silika, sedangkan fase gerak yang digunakan adalah pelarut. Pigmen hasil kromatografi kolom kemudian disimpan dalam botol dan dikeringkan dengan gas nitrogen. 3.2.2 Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi substansi-substansi penyusunnya. Pigmen yang diperoleh kemudian dilarutkan dalam aseton. Sebanyak 10 µl larutan tersebut ditotolkan pada pelat silika gel 60 F254 (Merck) kemudian dielusi menggunakan fase gerak aseton : eter : heksana dengan perbandingan 2 : 3 : 6. Pola pemisahan pigmen yang terbentuk kemudian dihitung Rf-nya. 19
3.2.3 Spektroskopi UV tampak Pigmen kering dilarutkan dalam aseton 100%, kemudian dianalisis pola spektranya menggunakan spektrofotometer UV tampak berkas rangkap Varian Cary 50 pada panjang gelombang 350-1100 nm. 3.3 Metode Penentuan Fotostabilitas Karotenoid dalam Campuran Karotenoid dengan Madu 3.3.1 Preparasi Larutan Uji Pelarut yang digunakan adalah aseton. Konsentrasi karotenoid dan madu yang digunakan adalah 1 molar. Campuran karotenoid dan madu memiliki perbandingan konsentrasi molar 1 : 1. 3.3.2 Uji Fotostabilitas Larutan karotenoid dan campuran karotenoid dengan madu dalam pelarut aseton diaduk dengan magnetik stirer dalam kuvet terbuka dan diiradiasi menggunakan lampu halogen 1800 lux. Untuk proses iradiasi diperlukan suatu alat yang lebih efektif untuk fotoradiasi pigmen yang akan dimasukkan didalam petri dish. Gambar berikut adalah alat yang telah dibuat khusus untuk mendapatkan suatu proses iridiasi yang lebih efektif. 20
Gb.3.2.1 Diagram alat penyinaran sampel Keterangan 1. Sumber tengangan / power supply 2. Lampu halogen 3. Metal casing. Menggunakan plat aluminium dicat berwarna hitam. 4. Cermin datar, dipasang pada sudut 45 5. Kaca setebal 1 cm 6. Fan Alat tersebut menggunakan cermin untuk memantulkan sinar, dan dua buah kaca setebal 1 cm. Kedua hal tersebut mempunyai tujuan yang sama yaitu untuk mencegah panas dari lampu langsung mengenai sampel. Sudut untuk cermin dibuat 45 0, hal tersebut bertujuan untuk mendapatkan sinat pantul yang tegak lurus (90 0 ) terhadap arah sinar asal. Tujuan penelitian ini adalah pengukuran fotostabilitas, oleh karena itu, pengaruh panas harus diminimalisasi. Panas akan berpengaruh terhadap stabilitas pigmen, oleh karena itulah alat ini dilengkapi dengan kaca, kipas dan bercat hitam untuk 21
meminimalisasi transfer panas dari sistem ke dalam sampel. Pada percobaan ini sumber tengangan yang digunakan adalah 12 V dan arus sebesar 4,5 Ampere untuk mendapatkan intensitas cahaya sebesar 1800 lux. Pengukuran intensitas cahaya dilakukan dengan menggunakan luxmeter. 3.3.3 Spektroskopi Near-Infrared Beberapa sampel disiapkan untuk kemudian diukur spektrum nya dengan menggunakan Büchi NIRFlex N-500 Solid. Sampel yang diukur meliputi petri kosong; pelarut; pigmen; madu; campuran pigmen dan pelarut; campuran madu dan pelarut. Sampel diletakkan pada petri dish dan ditutupi dengan penutup transflektan. Sampel mempunyai tebal sekitar 0,3 mm dari dasar petri dish dan permukaannya sebagai reflektor. Setiap spektrum diiukur dengan mode reflektan, jumlah scan 32 dan dalam jangkauan panjang gelombang 4000-10000 cm- 1. Pengulangan dilakukan sebanyak 3 kali yang kemudian dirata-rata untuk mendapatkan spektrum rata-rata dari sampel. 22
3.4 Analisa Data Data yang diperoleh dari 3 kali pengulangan dianalisa menggunakan statistika deskriptif dan program Matlab 6.5. Selain matlab, spektrum juga diolah dengan spectra manager for window 95/NT. Secara garis besar analisa spektrum sampel dilakukan sebagai berikut : Spektrum mentah (yang didapat dari spektrometer NIR) Mencari nilai rata-rata dari spektrum untuk masing-masing perlakuan Proses penyiapan awal spektrum untuk kemudian diproses dengan spektral manager meliputi pengubahan reflektan menjadi absoban, pembuatan head of file dengan excel, konversi data ke txt, interpolasi spektrum. Subtraksi spektrum Pencarian turunan kedua dengan matlab Analisa 23