POTENSI METABOLIT KAPANG ENDOFIT RIMPANG LENGKUAS MERAH DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus DENGAN MEDIA FERMENTASI POTATO DEXTROSE BROTH (PDB) DAN POTATO DEXTROSE YEAST (PDY) (The Potentials of Metabolite of Endophytic Mold of Alpinia galanga Rizome in Inhibiting the Growth of Eschericia coli dan Staphylococcus aureus by Using Potato dextrose broth (PDB) dan Potato dextrose yeast (PDY) as Fermentation Media) ENI KUSUMANINGTYAS 1, M. NATASIA 2 dan DARMONO 1 1 Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata No. 30, Bogor 16114 2 Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Srengseng Sawah Jagakarsa, Jakarta ABSTRACT Endophytic microbe is a microorganism living in host plant. This microbe helps the host to produce secondary metabolite that can inhibit pathogenic bacteria. This research was conducted to find out the ability of secondary metabolite of endophytic mold from Alpinia galangal rizome in inhibiting Eschericia coli and Staphylococcus aureus bacterial growth fermentation proses was done by using Potato Dextrose Broth (PDB) dan Potato Dextrose Yeast (PDY) media for 9 days, and then supernatant and biomass was separated.the result showed that supernatant was have ability to inhibit Eschericia coli and Staphylococcus aureus bacterial growth. Key Words: Endophytic mold, Alpinia galanga, E. coli, S.aureus ABSTRAK Mikroba endofit adalah mikroorganisme yang hidup dalam jaringan tanaman inangnya. Mikroba ini dapat membantu tanaman inangnya memproduksi senyawa metabolit sekunder yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui kemampuan metabolit sekunder kapang endofit rimpang Lengkuas Merah (Alpinia galanga L. Willd) dalam menghambat pertumbuhan bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus. Proses fermentasi dilakukan dengan menggunakan menggunakan media Potato Dextrose Broth (PDB) dan Potato Dextrose Yeast (PDY) selama 9 hari, setelah itu dipisahkan supernatan dengan biomassanya. Hasil fermentasi kapang endofit menunjukkan bahwa supernatan memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus. Kata Kunci: Kapang endofit, Lengkuas merah, E.coli, S.aureus PENDAHULUAN Resistensi antibiotika pada bakteri menuntut adanya penemuan obat baru yang lebih efektif dengan toksisitas rendah (STROBEL dan DAISY, 2003). Salah satu sumber alternatif obat-obatan adalah bahan yang diperoleh dari kapang endofit. Mikroba endofit ini dapat ditemukan pada seluruh bagian tanaman, dimana mikroba tersebut hidup di dalam tanaman (inang) tanpa menimbulkan penyakit pada inang itu sendiri. Beberapa penelitian mengenai mikroba endofit yang telah dilakukan, menunjukkan bahwa mikroba endofit dapat berperan dalam menghasilkan metabolit bioaktif (STROBEL et al., 1996). Metabolit yang dihasilkan oleh mikroba endofit diduga sama seperti yang terkandung dalam tanaman inangnya (PETRINI et al., 819
1992). Banyak penelitian mulai dilakukan mengenai hal ini, karena adanya kemungkinan terjadi transfer genetik antara tanaman inang dengan mikroba endofitnya, sehingga diharapkan zat-zat yang bermanfaat pada tanaman juga bisa dihasilkan oleh mikroba endofitnya (SYARMALINA et al., 2007). Metabolit bioaktif tersebut dapat bermanfaat di bidang industri pertanian maupun farmasi, diantaranya dapat menghambat pertumbuhan bakteri dan jamur, zat pengatur tumbuh tanaman dan sebagai anti tumor (STROBEL et al., 1996). Salah satu tanaman yang mengandung mikroba endofit adalah lengkuas merah (Alpinia galanga (L.) Wild). Lengkuas merah merupakan tanaman yang termasuk dalam familia Zingiberaceae. Rimpangnya banyak digunakan untuk aroma masakan, dan juga digunakan untuk obat. Penelitian sebelumnya tentang rimpang lengkuas merah menyebutkan bahwa ekstraksi dengan pelarut metanol, etanol, air menghasilkan bahan minyak atsiri, flavonoid dan polifenol dan berfungsi sebagai anti mikroba terhadap bakteri patogen penyebab penyakit seperti Eschericia coli, Staphylococcus aureus dan kapang patogen seperti Candida albicans, Trycophyton mentagrophytes (WINDONO et al., 2003; HERNANI et al., 2007). Hasil dari penelitian tersebut diketahui bahwa ekstrak dapat menghambat pertumbuhan bakteri dan kapang patogen sehingga mikroba yang terdapat di dalam rimpang tersebut diduga dapat menghasilkan senyawa yang memiliki efek yang sama dengan ekstrak tersebut. Berdasarkan uraian diatas, telah diketahui bahwa lengkuas merah (Alpinia galanga (L.) Wild) memiliki senyawa anti bakteri dan anti jamur. Kemampuan tersebut diduga berhubungan dengan kapang endofit yang terdapat dalam rimpang lengkuas merah. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian tentang aktivitas antimikroba kapang endofit lengkuas merah (Alpinia galanga (L.) Wild). Kapang endofit MATERI DAN METODE Kapang endofit yang digunakan merupakan hasil isolasi dari rimpang lengkuas merah. Dua kapang endofit yang dipakai pada penelitian ini adalah Fusarium sp dan Cladosporium sp. Produksi metabolit skunder Isolat kapang endofit yang telah murni ditumbuhkan dalam media Sabouraud dextrose agar (SDA) selama 5 hari hingga bersporulasi. Dengan menggunakan ose isolat yang telah murni tersebut diambil 5 potong dengan ukuran 1 1 1 cm dan dimasukkan ke dalam media Potato dextrose broth (PDB) dimasukkan ke dalam erlenmeyer 125 ml berisi 40 ml PDB. Erlenmeyer diinkubasi pada suhu ruang (27 30 C). dengan pengocokan dengan kecepatan 120 rpm selama 7 hari, kemudian diambil 20 ml dari media starter dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml yang berisi 200 ml media PDB. Setelah itu dilakukan fermentasi dengan pengocokan dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang (27 30 C). Pada hari ke-9 hasil fermentasi diambil dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang. Supernatan dipisahkan dari biomassanya untuk kemudian diuji kemampuan anti bakterinya. Metode yang sama dilakukan dengan menggunakan media Potato dextrose yeast (PDY). Persiapan mikroba uji Eschericia coli dan Staphylococcus Aureus diinokulasikan ke dalam media Nutrien Agar (NA). Inkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam Suspensi bakteri uji dibuat dengan melepaskan koloni yang tumbuh pada media dengan menggunakan ose kemudian dimasukkan kedalam masing-masing tabung yang berisi 5 ml aquadest steril. Suspensi diencerkan sehingga diperoleh suspensi bakteri uji dengan konsentrasi 10 4 CFU/ml untuk pengujian anti bakteri. Uji anti bakteri. Dimasukkan 1 ml supernatan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah dengan 1 ml suspensi bakteri uji kemudian di-vortex. Suspensi campuran dibuat seri pengenceran sampai 100 kali. Suspensi campuran dan hasil pengenceran kemudian dipindahkan ke dalam cawan petri masingmasing 1 ml, kemudian ditambahkan media NA dibiarkan bercampur dan mengeras. Cawan 820
Petri diinkubasikan pada suhu 37 C selama semalam. Koloni bakteri yang tumbuh dihitung. HASIL DAN PEMBAHASAN Medium fermentasi yang digunakan adalah PDB dan PDY, karena dalam media ini mengandung sumber karbon yang berasal dari kentang dan dextrose, serta ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen. Senyawa-senyawa sumber karbon dan nitrogen merupakan komponen terpenting dalam medium fermentasi, karena sel-sel mikroba dan berbagai produk fermentasi sebagian besar terdiri dari unsur-unsur karbon dan nitrogen, selain itu juga mengandung garam-garam organik serta beberapa vitamin dan mineral (KUMALA dan MUHAMAD, 2008). Medium cair yang digunakan pada fermentasi ini mempunyai beberapa keuntungan dibandingkan dengan medium fermentasi padat yaitu komposisi dan konsentrasi medium dapat diatur dengan mudah, dapat memberikan kondisi yang optimum bagi pertumbuhan, dan pemakaian medium lebih efisien (KUMALA dan MUHAMAD, 2008). Variasi medium fermentasi PDB dan PDY digunakan untuk membandingkan hasil fermentasi akhir mana yang lebih baik antara media fermentasi PDB dan PDY untuk menguji aktivitas anti bakteri. Hasil fermentasi isolat kapang endofit Sebelum dilakukan proses fermentasi dilakukan proses peremajaan kapang endofit terlebih dahulu, setelah itu hasil peremajaan dimasukkan ke dalam media starter selama 1 minggu baru kemudian dimasukkan ke dalam media fermentasi selama 9 hari. Hasil fermentasi berupa filtrat dan biomassa dapat dilihat pada Tabel 1. Dilihat dari hasil pertumbuhan kapang endofit pada media PDB dan PDY yaitu dengan menimbang berat biomassa pada akhir proses fermentasi dapat diketahui bahwa pertumbuhan kapang endofit Fusarium Sp. lebih baik pada media PDY sedangkan pada kapang endofit Cladosporium sp tumbuh lebih baik pada media PDB. Hal ini mungkin dikarenakan kapang endofit Fusarium sp. mampu memanfaatkan unsur nitrogen yang terdapat di dalam media PDY sedangkan kapang Cladosporium sp tidak dapat memanfaatkan unsur nitrogen tersebut secara optimal. Tabel 1. Hasil fermentasi kapang endofit lengkuas merah pada hari ke-9 Kode isolat Fusarium sp. Cladosporium sp. Media PDB PDY PDB PDY Hasil fermentasi Berat (g) 199,75 34,59 97,53 54,8 103,06 64,06 128,62 19,33 Hasil uji daya hambat supernatan kapang endofit terhadap pertumbuhan bakteri uji Bakteri uji dalam penelitian ini digunakan Eschericia coli sebagai bakteri gram negatif dan Staphylococcus aureus sebagai bakteri gram positif untuk melihat zat uji lebih berperan terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif. Selain itu penggunaan dua bakteri yang berbeda Gram tersebut bertujuan untuk membandingkan efektivitas zat anti mikroba yang terkandung di dalam zat uji lebih aktif dalam membunuh bakteri Gram positif atau bakteri Gram negatif. Efek antibakteri dari supernatan kapang endofit Fusarium Sp. dan Cladosporium Sp. media PDB dan PDY terhadap Eschericia coli dan Staphylococcus aureus dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2. Pada grafik tersebut dapat dilihat bahwa terjadi penurunan jumlah koloni bakteri dari kontrol walaupun penurunan jumlah koloni bakteri tersebut hanya sedikit. Hal ini membuktikan bahwa supernatan media fermentasi PDB dan PDY dapat menghambat pertumbuhan bakteri. 821
E. coli S. aureus (a) E. coli S. aureus (b) Gambar 1. Hasil uji antibakteri supernatan kapang Fusarium sp. media fermentasi PDB (a); dan PDY (b) terhadap Eschericia coli dan Staphylococcus aureus Gambar 2. Hasil uji antibakteri supernatan kapang endofit Cladosporium sp. media fermentasi PDB (a); dan PDY (b) terhadap Eschericia coli dan Staphylococcus aureus 822
Dilihat dari hasil perbandingan antara supernatan kapang Fusarium sp media fermentasi PDB dan PDY dapat diketahui bahwa supernatan lebih menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus daripada menghambat pertumbuhan bakteri Eschericia coli. Hal ini mungkin dikarenakan oleh komponen penyusun dinding sel dari masing-masing bakteri tersebut berbeda. Pada bakteri Gram positif struktur dinding sel berlapis tunggal dan memiliki kandungan lipid yang rendah yaitu 1 4%, sedangkan pada bakteri Gram negatif mempunyai dinding sel yang berlapis tiga yaitu lipoprotein, membran luar fosfolipid dan lipopolisakarida serta kandungan lipid yang tinggi yaitu 11 22% (Jawetz et al., 1996). Membran luar fosfolipid dapat mengurangi masuknya zat anti bakteri ke dalam sel, oleh karena itu zat anti bakteri yang terkandung di dalam supernatan kapang endofit Fusarium sp media fermentasi PDB dan PDY lebih aktif dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dibandingkan dengan Eschericia coli. Pada supernatan kapang endofit Cladosporium sp. media fermentasi PDB dan PDY lebih besar daya hambatnya terhadap pertumbuhan bakteri Eschericia coli dibandingkan dengan Staphylococcus aureus. Hal ini dapat dikarenakan oleh pada bakteri Gram positif mempunyai struktur dinding (15 80 nm), berlapis tebal dan mengandung peptidoglikan lebih dari 50 80% berat total dinding sel, polisakarida dan asam teikoat. Ketiga komponen dinding sel tersebut terikat secara kovalen untuk menghasilkan bahan dinding sel yang berukuran sangat besar dan kompleks, sehingga zat anti bakteri yang terkandung di dalam supernatan tidak dapat menembus ke dalam sel dan tidak mempengaruhi kehidupan bakteri Gram positif tersebut. Sedangkan bakteri Gram negatif, mempunyai struktur dinding sel yang lebih tipis (2 3 nm), dan mengandung peptidoglikan yang lebih sedikit dibandingkan dengan bakteri Gram positif yaitu 1 10% berat total dinding sel, sehingga zat anti bakteri yang terkandung di dalam supernatan dapat masuk ke dalam sel bakteri Gram negatif tersebut (JAWETZ et al., 1996). Hal ini berarti senyawa aktif terhadap Gram negatif lebih dominan dibandingkan dengan zat aktif terhadap Gram positif. Supernatan dapat menghambat pertumbuhan kedua bakteri, tetapi pengujian terhadap supernatan merupakan langkah awal untuk mengetahui potensi dari metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit. Setelah diketahui adanya daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri maka dapat dilakukan proses ekstraksi dengan tujuan untuk mengetahui zat aktif yang terdapat di dalam supernatan tersebut lebih berpotensi dengan diekstraksi atau cukup dengan supernatan saja. KESIMPULAN Berdasarkan pengukuran berat biomassanya, Fusarium Sp. tumbuh lebih baik pada media PDY sedangkan Cladosporium Sp. tumbuh lebih baik pada media PDB. Metabolit skunder yang merupakan hasil fermentasi kapang endofit menunjukkan adanya kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus. Fusarium sp. dengan media fermentasi PDB dan PDY lebih aktif dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Cladosporium sp. dengan media fermentasi PDB dan PDY lebih besar daya hambatnya terhadap pertumbuhan bakteri Eschericia coli. DAFTAR PUSTAKA HERNANI, E. KUSUMANINGTYAS dan ABUBAKAR. 2007. Senyawa Antijamur dari Lengkuas Merah. Pros. Seminar Nasional dan Pameran Perkembangan Teknologi Tanaman Obat dan Aromatik. Bogor, 6 September 2007. Puslitbang Perkebunan, Balitro, Bogor. JAWETZ, Z.E., J.L. MELNICK and E.A. ADEBERG. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20, Diterjemahkan oleh: EDI, N. dan R.F. MAULANY. EGC, Jakarta. KUMALA, S. dan G. MUHAMAD. 2008. Isolasi dan Penapisan Kapang Endofit Tanaman Secang sebagai Penghasil Senyawa Antibakteri. J. Ilmu Kefarmasian Indonesia. 21(2): 15 17. PETRINI, O., T.N. SIEBER, L. TOTI and O. VIRET. 1992. Ecology, metabolite production and substrate utilization in endophytic fungi. Natural Toxin 1: 185 194. STROBEL, G.A., W.M. HESS, E. FORD, R.S. SIDHU and X. YANG. 1996. Taxol from fungal endophytes and the isue of biodiversity. J. Industrial Microbiol. 17: 417 425. 823
SYARMALINA, W. LELY dan N. LAUPA. 2007. Uji sitotoksik hasil fermentasi kapang endofit buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) terhadap sel MCF-7. J. Ilmu Kefarmasian Indonesia 5(1): 23 24. WINDONO T, H.H. POPPY, R. LINCE, S. MAYA dan H.J. GWANG. 2003. Pengujian daya hambat pertumbuhan Staphylococcus aureus ATCC 25923 ekstrak metanol beberapa rimpang tanaman zingiberaceae. Media Pharmaceutica Indonesiana 3(1): 2 5. 824