BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian Eksperimen Murni dengan rancangan penelitian One Group Pre and Post Test With Control Design yang digambarkan sebagai berikut : [33] Pretest Treatment Postest Kel. Eksperimen O 1 T 1 O 2 O 1 T 2 O 2 O 1 T 3 O 2 Kel. Kontrol O 1 T 4 O 3 O 1 T 5 O 3 Gambar 3.1 Skema Rancangan Penelitian Keterangan : O 1 : Hasil pengukuran Glukosa pada tikus sebelum perlakuan (kadar glukosa awal) T 1 3 : Pemberian 3 peringkat konsentrasi infusa kelopak bunga rosella T 4 : Kontrol negatif pemberian suspensi CMC Na 0,5 % T 5 : Kontrol positif pemberian suspensi Metformin dosis 189 mg/kgbb O 2 : Hasil pengukuran Glukosa pada tikus setelah perlakuan O 3 : Hasil pengukuran Glukosa pada tikus dalam kelompok kontrol B. Subjek dan Sampel Penelitian 1. Subjek Penelitian Subjek dalam penelitian ini adalah seluruh tikus putih galur wistar. 2. Sampel Penelitian Sampel dalam penelitian ini adalah tikus jantan putih galur wistar yang berumur 2 bulan dengan berat badan antara 150-200 gram.
3. Besar Sampel Besar sampel dalam penelitian ini adalah 30 ekor dengan perhitungan jumlah perlakuan x jumlah pengulangan x jumlah tikus = 5 x 5 x 1 = 25 ekor dan 5 ekor sebagai cadangan jika pada saat perlakuan mati. 4. Replikasi Eksperimen Untuk menghindari kesalahan sekecil mungkin maka banyaknya replikasi dalam eksperimen dihitung dengan rumus : [34] (t 1) (r 1) 15 (5 1) (r 1) 15 4 (r 1) 15 4r 4 15 4r 15 + 4 4r 19 r 4,75 r = 5 Keterangan: t : Jumlah perlakuan r : Jumlah ulangan Pengulangan dilakukan pada masing-masing perlakuan sebanyak 5 kali pengulangan. C. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari tanggal 28 Juni 2010 sampai 6 Juli 2010 di Laboratorium Farmakologi Universitas Wahid Hasyim Semarang. D. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel Bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi infusa kelopak bunga rosella yang dibuat 3 tingkat konsentrasi, dengan dasar konsentrasi dari infusa adalah 100 mg/ml, kemudian diberikan 2,5 ml/200 BB tikus,
sehingga diperoleh 3 peringkat konsentrasi infusa 62,5 mg/200g BB, 125 mg/200g BB dan 250 mg/200g BB. Satuan : mg/l Skala : ordinal 2. Variabel terikat Variable terikat dalam penelitian ini adalah penurunan kadar glukosa darah tikus putih jantan galur wistar sebelum dan sesudah diberi infusa kelopak bunga rosella. Satuan : gr/dl Skala : interval 3. Variabel terkendali Variabel terkendali dalam penelitian ini adalah berat badan, umur dan jenis kelamin tikus. a. Berat badan adalah berat badan awal tikus yang digunakan yaitu antara 150-200 gram yang di timbang menggunakan neraca analitis dengan ketepatan 0,01 gram. Satuan : gram Skala : rasio b. Umur adalah lama waktu hidup tikus dari saat dilahirkan sampai dilakukan penelitian. Tikus yang digunakan adalah tikus yang berumur 2 bulan. Satuan : bulan Skala : rasio c. Jenis Kelamin adalah bagian dari anatomi tubuh yang berupa jantan atau betina. Jenis kelamin yang digunakan pada percobaan ini dibuat seragam dengan jenis kelamin jantan. Secara hormonal tikus putih jantan lebih stabil dibandingkan dengan tikus putih betina karena tikus putih betina mengalami masa esterus dan bunting. Satuan : - Skala : nominal
d. Kelopak Bunga Rosella Kelopak bunga rosella yang digunakan dalam penelitian ini adalah berumur tiga bulan dan diperoleh dari perkebunan ekowisata Tlatar Boyolali. E. Metode Pengumpulan Data 1. Pengumpulan Data Primer Data yang dikumpulkan berupa nilai serapan kadar glukosa darah pada tikus putih jantan galur wistar yang diinduksi glukosa (mg/dl) dari menit ke-0 sampai menit ke-300 yang dihitung dengan menggunakan rumus: As Ab C = 100mg dl Ast Ab Keterangan: C : kadar glukosa darah As : serapan larutan sampel Ast : serapan larutan standar Ab : serapan larutan blanko 2. Pengumpulan Data Sekunder Pengumpulan data yang diperoleh dari Studi Pustaka yang berasal dari buku buku, Majalah/Jurnal yang dapat mendukung penelitian yang akan dilakukan, berupa deskripsi dan manfaat tanaman rosella, prosedur pembuatan infusa, hewan uji yang digunakan dalam penelitian, hal yang mempengaruhi penurunan kadar glukosa darah. F. Prosedur Penelitian Langkah-langkah yang akan dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Determinasi tanaman rosella Determinasi tanaman rosella dilakukan di Laboratorium Taksonomi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Jurusan Biologi Universitas Negeri Semarang dan dideterminasi menurut cara dalam buku Flora Of Java [35] dan Flora untuk sekolah di Indonesia [36]
2. Pembuatan Simplisia dan Penyarian Kelopak bunga rosella yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari daerah Tlatar Boyolali dan telah berumur 3 bulan. Proses awal pembuatan simplisia adalah melakukan pencucian kelopak bunga rosella di bawah air mengalir untuk menghilangkan bahan asing dan tanah atau debu yang menempel, kelopak bunga rosella yang telah bersih kemudian dipotong-potong dilanjutkan dengan proses pengeringan dibawah sinar matahari secara langsung dengan ditutupi kain hitam. 3. Pembuatan infusa kelopak bunga rosella a. Alat dan bahan yang digunakan 1). Alat: a). Pisau b). Neraca Analitis c). Panci infusa d). Termometer Celcius e). Kompor listrik f). Batang pengaduk g). Beacker glass merk pyrek volume 100 ml h). Gelas ukur merk pyrek volume 500 ml i). Kain kassa untuk menyaring 2). Bahan: a). 10 gram kelopak bunga rosella b). Aquadestilata b. Tahap pelaksanaan 1). Sebanyak 10 gram kelopak bunga rosella yang telah dipotongpotong ditambahkan dengan aquadest sejumlah 100 ml dimasukkan kedalam panci infusa. 2). Dipanaskan di atas kompor listrik selama 15 menit, terhitung mulai suhu mencapai 90 o C sambil sekali-sekali diaduk. 3). Diserkai selagi masih panas melalui kain, kemudian ditambahkan air panas secukupnya hingga diperoleh volume infusa sebanyak 100 ml.
4. Pembuatan Suspensi CMC-Na 0,5% sebagai kontrol negatif Suspensi CMC-Na 0,5% dibuat dengan menimbang CMC-Na 0,5 gram, kemudian tambahkan air panas ad 100 ml, aduk sampai homogen. Diberikan secara peroral pada hewan uji sebagai larutan kontrol negatif. 5. Pembuatan Suspensi Infusa kelopak Bunga Rosella Adapun pembuatan stok untuk suspensi infusa kelopak bunga rosella adalah sebanyak 250 mg ditambah CMC-Na 0,5% ad 50 ml. Dari larutan stok tersebut yang diberikan kepada hewan uji dengan volume yang ditetapkan berdasarkan tingkat konsentrasi. 6. Penentuan Konsentrasi Infusa dan Obat yang digunakan a. Konsentrasi Infusa Kelopak Bunga Rosella Konsentrasi infusa kelopak bunga rosella dalam penelitian ini dibuat 3 peringkat konsentrasi, dengan dasar konsentrasi awal dari infusa adalah 100 mg/ml, kemudian diberikan 2,5 ml/200 BB tikus, sehingga diperoleh 3 peringkat konsentrasi infusa 62,5 mg/200g BB, 125 mg/200g BB dan 250 mg/200g BB. b. Konsentrasi Obat yang digunakan sebagai kontrol positif adalah Metformin Konsentrasi Metformin yang sering dipergunakan adalah 500 mg (3 dd)-850 mg (2 dd) Konsentrasi untuk manusia dengan berat badan 70 kg adalah: 70 1500 mg = 2100 mg [13]. 50 Faktor konversi manusia 70 kg ke tikus 200 g adalah 0,018 Konsentrasi Metformin : 2100 mg 0,018 = 37,8 mg Berat tikus 200 g : 1000 37,8 mg = 189 mg/kgbb 200 Berdasarkan hasil perhitungan tersebut maka konsentrasi Metformin yang digunakan dalam penelitian ini adalah 189 mg/kgbb.
7. Uji penurunan kadar gula darah. a. Alat dan bahan yang digunakan 1). Alat a). Spektrofotometer UV(Genesis) b). Alat pemusing (Vortex Mixer) c). Neraca analitik elektrik (OHAUS Adventurer) d). Mikropipet volume 1 ml e). Alat pengambil darah tikus (holder, scalpel, tabung eppendorf) f). Spuit oral g). Panci infusa h). Penangas air i). Chamber (bejana eluasi) j). Mikropipet k). Pisau steril l). Vortex (Sentrifuge PLC series) m). Timbangan tikus (DAEMA) 2). Bahan a). Kelopak bunga Rosella b). Tikus putih jantan galur wistar sebanyak 30 ekor, berumur ± 2 bulan dengan berat badan 150-200 gram. c). Aquadestilata d). Reagen pemeriksaan kadar glukosa darah: GOD-PAP dari Diagnostic Systems International (Diasys), yang terdiri dari: Monoreagen Dapar fosfat (ph 7,5) 250 mmol/l Fenol 5 mmol/l 4-aminoantipirin 0,5 mmol/l Glukose oksidase >10 mmol/l Peroksidase >1 mmol/l Larutan glukosa standar 100 mg/dl = 5,55 mmol/l
e). Bahan kimia; Etanol 70% (Pharmaceutical Grade, PT. Brataco Chemika), CMC-Na 0,5% (Pharmaceutical Grade, PT. Brataco Chemika) dan D-glukosa monohidrat (PT. Merck Indonesia) f). Obat yang digunakan sebagai kontrol positif adalah Metformin (PT.PHAPROS) b. Tahap pelaksanaan 1). Sebanyak 25 ekor tikus putih galur wistar yang akan digunakan terlebih dahulu dipuasakan selama 18 jam 2). Dibagi secara acak dalam 5 kelompok yang mana tiap kelompok berisi 5 ekor tikus, 3). Masing-masing kelompok diberi secara oral sediaan berikut ini: Kelompok I : sebagai kontrol negatif diberi suspensi CMC-Na 0,5% sebanyak 2,5 ml/200 kgbb. Kelompok II : diberi infusa kelopak bunga rosella dengan konsentrasi 62,5 mg/200gbb. Kelompok III : diberi infusa kelopak bunga rosella dengan konsentrasi 125 mg/200gbb. Kelompok IV : diberi infusa kelopak bunga rosella dengan konsentrasi 250 mg/200gbb. Kelompok V : sebagai kontrol positif diberi suspensi Metformin dengan konsentrasi 189 mg/kgbb. 4). Setelah pemberian sediaan suspensi 30 menit kemudian, masingmasing tikus diberi larutan D-glukosa monohidrat dengan konsentrasi 2 g/kg BB secara per oral. 5). Ditentukan kadar glukosa darahnya pada menit ke 0, 30, 60, 120, 180, 240 dan 300. 6). Dilakukan Evaluasi terhadap efek penurunan kadar glukosa darah terhadap waktu sampling 0-300 menit [37]
8. Idenfikasi Flavonoid a. Alat dan bahan yang digunakan : a). Alat : a). Tabung reaksi b). Pipet tetes c). Gelas ukur 10 ml d). Rak tabung reaksi b). Bahan a). Infusa Kelopak Bunga Rosella b). Etanol 95% c). Serbuk Zn d). HCl 2 N e). HCl pekat f). Serbuk Mg b. Tahap pelaksanaan : 1). Ke dalam tabung reaksi dimasukkan sebanyak 1 ml infusa ditambahkan dengan 1 ml etanol 95% kemudian dimasukkan sebanyak 0,5 g serbuk Zn dan 2 ml HCl 2 N didiamkan selama 1 menit. Tambahkan 10 tetes HCl pekat, jika dalam waktu 2 5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid. 2). Ke dalam tabung reaksi dimasukkan sebanyak 1 ml infusa ditambahkan dengan 1 ml etanol 95% kemudian dimasukkan sebanyak 0,1 g serbuk Mg dan 2 ml HCl 2 N didiamkan selama 1 menit. Tambahkan 10 tetes HCl pekat, jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoid. [38] G. Metode Pengolahan dan Analisis Data 1. Pengolahan Data a. Editing Adalah memeriksa data yang telah dikumpulkan agar tidak terjadi kesalahan.
b. Entri Data Adalah memasukkan data yang telah diperoleh dengan cara menggunakan komputer. c. Tabulasi Adalah melakukan pengelompokkan data ke dalam tabel sehingga memudahkan untuk dianalisis. 2. Analisis Data a. Analisis Univariat Yaitu analisis yang menjelaskan/mendeskripsikan data masing masing variabel dengan menggunakan tabel distribusi frekuensi, rata rata (mean), minimum dan maksimum, serta standar deviasi. b. Analisis Bivariat 1. Uji perbedaan Data kadar glukosa darah tiap tikus dibuat kurva kadar glukosa darah terhadap waktu dan dihitung persentase penurunan kadar glukosa darah. Data persentase penurunan kadar glukosa darah yang diperoleh dari masing-masing kelompok dianalisis dengan uji normalitas menggunakan uji Kolmogorof Smirnov. Data menunjukkan terdistribusi normal, dan dilanjutkan uji One Way Anova. 2. Uji lanjutan Post hoct test untuk melihat perbedaan antar perlakuan dengan uji LSD (Least Significant Different).