Penyiapan Kultur Starter Bioindustri Minggu 6 Oleh : Sri Kumalaningsih, dkk
Pendahuluan Beberapa faktor yang mempengaruhi keberhasilan produksi barang dan jasa dengan menggunakan mikroorganisme diantaranya adalah kultur starter, kondisi lingkungan dan media yg digunakan. Salah satu penentu keberhasilan kultur adalah penyiapan kultur starter yang baik Untuk itu perlu dipelajari tentang penyiapan kultur dan mikroorganismenya.
Kultur starter (Holzapfel, 2002; Tarmine 1990) Bahan yang mengandung sejumlah besar mikroorganisme untuk mempercepat proses fermentasi Medium segar berupa nutrien dg jumlah ttt yang telah diinokulasikan dg mikroorganisme pd jumlah ttt pula Mikroorganisme yang dimaksud adalah bakteri, kapang, khamir atau kombinasi diantara ketiga jenis mikroorganisme tersebut.
SUMBER MIKROBIA INDUSTRI a. Sumber Alami : dari tanah, air sungai, laut, tanaman, hewan, limbah, dan kotoran dengan menggunakan metode isolasi b. Koleksi kultur : dari lembaga tempat menyimpan dan memelihara mikro-organisme.
Seleksi Mikroba Industri Tahap pertama adalah isolasi mikroba, sehingga diperoleh kultur murni (sifat morfologi & fisiologi seragam). Tahap kedua adalah seleksi sehingga diperoleh galur dengan kinerja terbaik. Tahap ketiga dilakukan identifikasi dengan menggunakan kunci-kunci yang sesuai, sehingga diketahui nama (klasifikasi) mikroba tersebut Tahap keempat adalah menyimpan mikroba yg telah diperoleh dgn teknik penyimpanan yg baik, sehingga kemurniannya terpelihara dalam jangka waktu yg panjang.
Kriteria Mikroba Industri Merupakan galur murni Sifat genetiknya stabil Dpt m hasilkan sel vegetatif, spora atau unit-unit reproduktif lain Mampu tumbuh dengan cepat setelah diinokulasi Mampu menghasilkan produk yg diinginkan dalam waktu yg pendek & tdk menghasilkan produk sampingan yg toksik Mampu melindungi diri dari kontaminasi (ph, suhu, inhibitor) Dapat disimpan dalam jangka waktu yang panjang Galur dpt dikembangkan kualitasnya (mutasi), shg produksinya meningkat
Hal yg perlu diperhatikan saat melakukan seleksi Sensitivitas Tidak mahal Dpt digunakan utk memprediksi hasilnya nanti Sederhana Dpt ditingkatkan ke cara lebih modern (otomatisasi)
Fungsi seleksi Harus dihasilkan produk baru yang kompetitif, bermutu tinggi, harga bersaing, tanpa meninggalkan konsep lingkungan Meningkatkan Konsumsi produk menggunakan mikroorganisme dan enzim untuk pangan dan obatobatan Menjawab tantangan peningkatan kapasitas produk Memenuhi kebutuhan penelitian dasar dan pengembangannya Rekayasa pengolahan harus dilakukan
PENYIAPAN KULTUR Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari campuran biakan mikroba di alam sel individu terpisah Sebelum mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan diisolasi dan habitatnya menentukan sampel apa yang akan diambil dari alam dan media apa yang akan digunakan Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu dingin (kulkas)
Teknik Isolasi Kultur Murni Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate) Penuangan (Pour-plate) Kultur yang Diperkaya Pengenceran Berseri (Serialdilution) Isolasi Sel Tunggal
TEKNIK ISOLASI a. Teknik Penggoresan (Streak-plate) dan Penyebaran (Spread-plate) Menggunakan agar cawan Untuk bakteri paling sesuai Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri & menggunakan peralatan yang sederhana. Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat digunakan/disebarkan pada media Dua sel dapat bergabung manjadi membentuk satu koloni, contoh : bakteri yang menghasilkan lendir & yang tidak pencegahan dengan menambahkan deterjen
Teknik Penggoresan (Streak-plate) dan Penyebaran (Spread-plate) Sampel Pengenceran berseri dg larutan garam fisiologis (0,85 %) Penggoresan (jarum Ose) atau penyebaran (batang gelas) pada media agar, sehingga koloni tumbuh menyebar Penggoresan dilakukan berulang, sehingga Diperoleh kultur murni 1 sel 1 koloni
Teknik Penggoresan (Streak-plate) dan Penyebaran (Spread-plate) Goresan T Goresan Kuadran
b. Teknik Penuangan (Pour-plate) Metode Penuangan Pengamatan dapat dilakukan secara kualitatif (morfologi) & kuantitatif (jumlah sel mikroba) Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif dengan menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan perlakuan khusus sebelum penanaman pada agar cawan Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora contoh dipanaskan terlebih dulu s.d 85 0 C 5 menit
Lanjutan... Media Selektif : a. Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasi Staphylococcus dari faeces b. Media BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) : Salmonellae Media Diferensial : Media agar EMB (eosin-methylene blue agar) terbentuk koloni berbeda & mudah dikenali Misal : E. coli : hijau kehitaman/hijau metalik Aerobacter aerogenes : tengah ungu tua/coklat, tepi ungu muda
Teknik Penuangan (Pour-plate) Sampel +/- 1 g) 1 loop A Agar cair...... A Diperiksa Suspensi Bakteri B C Pengenceran Penuangan Dibiarkan mengeras.................. B C Koloni terisolasi Inkubasi Tahap I Tahap II Tahap III Media agar miring
c. Teknik Kultur yang Diperkaya Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat fisiologis yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat) Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentu Cara: 1 2 3 4 Media cair dgn substrat khusus Contoh : bakteri tanah : α-conidendrin (+) (-) Verifikasi
d. Teknik Pengenceran Berseri (Serial dilution) Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat dalam jumlah lebih besar dari pada mikroba lain. Contoh : S. lactis dalam susu asam Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya mengandung 1 galur mikroba Perlu dicek kemurnian kultur
e. Tenik Isolasi Sel Tunggal Menggunakan alat Mikromanipulator yang digabung dengan mikroskop untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari preparat tetes Dengan Mikromanipulator, operator dapat mengontrol gerakan mikropipet di bawah lensa obyek, sehingga dapat diambil sel tunggal ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media yang sesuai Lebih cepat, namun kelemahannya : alat mahal & operator harus trampil
1. Morfologis TEKNIK IDENTIFIKASI Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan pewarnaan maupun tidak. 2. Nutrisional Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu, cahaya, gas) yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba 3. Kultural Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam media,baik cair maupun padat (bentuk koloni, permukaan koloni, tepi koloni, warna dll 4. Susunan Kimiawi Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding sel, nukleus, membran dll)
Contoh 1. Karakteristik Morfologis Aspergillus E. coli Streptomyces Penicillium
Contoh 2. Karakteristik Kultural
Lanjutan... 5. Metabolik Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang dilakukan mikroba ( kemampuan mikroba untuk mengubah karbohidrat menjadi asam organik; gula menjadi asam dan gas dll) Contoh : E. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan Salmonella typhi tidak dapat 6. Susunan antigen Penelaahan sifat antigen antibodi yang khas Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi produksi antibodi saat diinjeksikan ke hewan 7. Patogenik Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan penyakit 8. Genetik Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA Probe
PEMELIHARAAN DAN PENGAWETAN Tujuan : menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam kondisi hidup (viable), mencegah terjadinya perubahan genetik & tidak terkontaminasi harus mampu melestarikan karakteristik spesies mikroba selama diawetkan Cara : 1. Pemindahan Secara Periodik 2. Pelapisan kultur dengan minyak mineral 3. Liofilisasi 4. Penyimpanan pada suhu sangat rendah 5. Penyimpanan pada tanah steril
PEMELIHARAAN DAN PENGAWETAN a. Pemindahan Secara Periodik Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke media baru/segar Komposisi media & suhu serta interval waktu pemindahan harus tepat tetap mempertahankan kultur awal b. Pelapisan Kultur dgn Minyak Mineral Permukaan agar miring dilapisi dengan minyak mineral steril (+/- 0,5 inci) Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba di bawah minyak mineral dg jarum Ose, lalu diinokulasi ke media segar dengan tetap mempertahankan kultur awal c. Penyimpanan pada Tanah Steril Diterapkan untuk penyimpanan spora
d. Liofilisasi Pengeringan beku (freeze-drying) Merupakan cara paling efektif untuk mengawetkan kultur bakteri (dapat tetap hidup & tidak berubah lebih dari 20 th) Keuntungan : Tahan lama, Kemungkinan perubahan kecil, Wadah penyimpanan kecil e. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah Menggunakan nitrogen cair (sekitar -176 0 C) Sel dibekukan dengan diberi pelindung (gliserol atau dimetil sulfoksida) Contoh beku disimpan dalam lemari pendingin nitrogen cair Cocok untuk kapang Kelebihan : hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidak dapat diawetkan dengan liofilisasi, dapat dengan cara ini