BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Jenis Penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian True Experimental yang menggunakan metode the posttest only group design dimana sampel di pilih secara acak dan dibagi menjadi 6, yaitu 3 kontrol, masing masing kontrol (K+), kontrol negatif (K-) dan kontrol hewan sehat (HS) dan 3 uji (P1, P2, P3). 4.2 Tempat Dan Waktu Penelitian 4.2.1 Ekstrak Tanaman Laboratorium Sintesa Jurusan Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah malang. Waktu penelitian yaitu pada Maret 2016. 4.2.2 Pengujian Aktifitas Laboratorium Sintesa Jurusan Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah malang. Waktu pelaksanaan kegiatan pada bulan Maret 2016. 4.3 Populasi dan sampel 4.3.1 Populasi Design penelitian ini adalah Eksperimental Laboratorium dengan menggunakan jenis Randomized group post test design. Hewan coba yang digunakan adalah tikus jantan jenis Rattus Novergicus galur Wistar. Tikus yang digunakan adalah tikus sehat yang ditandai dengan perilaku dan memiliki nafsu makan yang baik. 4.3.2 Sampel Pada penelitian Eksperimental, belum banyak rumus yang dikembangkan untuk menentukan besar sampel yang dibuutuhkan. Untuk menentukan besar sampel (replikasi yang dibutuhkan digunakan rumus berikut : 37
38 (t-1)(n-1) 15 Keterangan : (6-1)(n-1) 15 t : jumlah perlakuan 5(n-1) 15 n : replikasi (jumlah sampel) 5n-5 15 5n 20 n 4 Dari data perhitungan tersebut, didapatkan data untuk enam perlakuan dibutuhkan jumlah sampel atau replikasi sebanyak minimal 4 ekor hewan coba. Tikus (Rattus norvegicus) diadaptasikan terlebih dahulu selama 7 hari (Gani et al, 2013) dan diberi pakan standar. Untuk sehat, 5 tikus ditempatkan pada kandang berukuran ± 17,5 x 23,75 x 17,5 cm berbahan plastik dan berpenutup kawat. Sedangkan untuk kontrol negatif, kontrol, P1, P2, P3, tiap 2 tikus ditempatkan pada kandang berukuran ± 17,5 x 23,75 x 17,5 cm berbahan plastik, bersekat kawat pada bagian tengah dan berpenutup kawat.kandang ditempatkan di tempat bebas polutan dan kebisingan. 4.4 Alat dan Bahan 4.4.1 Alat 1. Blender 2. Timbangan untuk menimbang daun dan ekstrak Persea americana dan Annona squamosa 3. Bejana kapasitas 5L 4. Beaker glass 1 L 5. Batang pengaduk 6. Kertas saring 7. Corong buchner 8. Erlenmeyer 500 ml 9. Rotary Evaporator 10. Corong gelas 11. Bejana untuk uji KLT 12. Lempeng silica gel untuk uji KLT 13. Cawan Porselen 14. Spatula logam 15. Mortir dan stamper 16. Gelas ukur 17. Timbangan untuk menimbang tikus (Rattus norvegicus) 18. Kandang
39 19. Penutup kandang dari anyaman kawat 20. Botol minum tikus 21. Sonde 4.4.2 Bahan 1. Hewan percobaan tikus putih ( Rattus norvegicus L) 2. Simplisia daun srikaya ( Annona squamosa ) 3. Simplisia daun alpukat ( Persea americana ) 4. Etanol 96% 5. Aqua destilata 6. CMC-Na 7. 4-amino antipirin 8. Cholesterol esterase 22. Spuit 23. Kapas 24. Mikropipet 200 µl, 500 µl 25. Auto analyser Konelab 200XT 9. Cholesterol oxidase 10. Detergen (surfaktan) 11. DSBmt 12. Peroxidase 13. Good s buffer solution 14. N-heksan 15. Etil asetat 16. Makan tinggi lemak dan kalori 17. Pakan standart/pellet 18. Simvastatin 4.5 Pengumpulan Data 4.5.1 Ekstraksi 1. Ekstrak Daun Srikaya (Annona squamosa) Dari ekstraksi 1,5 kg serbuk daun annona squamosa L. di rendam di dalam bejana dengan etanol 96% sebanyak 6L dan dibiarkan selama 24 jam. Hasil rendaman kemudian di saring dengan corong buchner untuk memperoleh filtrate. Filtrat kemudian ditampung dan di uapkan dengan rotavapour hingga di peroleh ekstrak kental. Residu hasil penyaringan di rendam kembali dengan etanol 96% sebanyak 3 L dan di biarkan 24 jam kemudian di saring dan di uapkan dengan cara yang sama. Proses ini dilakukan sampai di peroleh ekstrak kental yang berwarna coklat kehitaman sebanyak 193,41 gram. Golongan senyawa flavonoida yang terdapat pada ekstrak, di identifikasi dengan metode
40 Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Fase diam yang di gunakan adalah silica GF245 dengan fase gerak yang terdiri dari campuran kloroform dan etilasetat dengan perbandingan sama banyak. Daun Annona squamosa Linn dikeringkan pada suhu ruangan selama satu minggu. Daun Annona squamosa L. kering kemudian dihancurkan dengan menggunakan alat penggiling. Serbuk yang sudah ditimbang kemudian diekstraksi menggunakan etanol sebagai pelarut. Larutan kemudian dievaporasi sampai memperoleh ekstrak kental. Ekstrak disimpan pada suhu 2-80 sampai akan digunakan. Ekstraksi 1,5 kg serbuk daun srikaya Maserasi dengan pelarut 6 L etanol 96% selama 24 jam Disaring Filtrat ditampung Residu Direndam di dalam bejana dengan etanol 96% 3L dibiarkan selama 24 jam Di saring dan di uapkan Di peroleh ekstak kental daun srikaya Gambar 4.1 Bagan Alir Proses Ekstraksi Srikaya ( Annona squamosa ) 2. Ekstraksi Daun Alpukat (Persea Americana) Ekstraksi daun Alpukat di lakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96% dengan perbandingan 1 : 10. Simplisia serbuk kering daun alpukat 500 gram di rendam dengan etanol 96% sebanyak 2L dan dibiarkan selama 24 jam. Hasil ekstraksi disaring dengan kertas saring dan dipisahkan dari endapannya. Ekstraksi daun alpukat kemudian di evaporasi menggunakan rotary
41 vacuum evaporator untuk menghilangkan pelarut dalam ekstraksi, dengan suhu di bawah titik didih pelarut (50-60 ). Residu hasil penyaringan di kumpulkan kembali dan di rendam dengan etanol 96% sebanyak 1,5L dan di biarkan selama 24 jam (proses ini dilakukan 2 kali) hingga di peroleh filtrat yang kental. Simplisia serbuk kering daun alpukat 500 gram Maserasi di dalam bejana dengan etanol 96% 6 L dibiarkan selama 24 jam Disaring Residu Dipisah dari endapannya Maserasi di dalam bejana dengan etanol 96% 1,5 L di biarkan selama 24 jam Di uapkan dengan rotavapor Di peroleh ekstrak kental daun alpukat Gambar 4.2Bagan Alir Proses Ekstraksi Daun Alpukat 4.5.2 Persiapan Hewan Coba Sampel yang digunakan sebanyak 24 ekor tikus jantan Sprague Dawley dengan berat badan rata-rata 140-260 gram dan berumur 8 minggu yang diperoleh dari Lembaga Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPTT) UGM Yogyakarta. Pada penelitian ini menggunakan 4 perlakuan yang masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus. Penentuan besar sampel menggunakan rumus besar sampel eksperimen Fedeer, yaitu (t-1)(n-1) 15. Pengelompokkan tersebut dilakukaan secara acak sederhana dengan
42 pembeerian nomor pada ekor tikus yang kemudian nomor tersebut diambil dengan system lotere. Masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus yang dirawat dalam kandang individu. Keempat diberi pakan standart ADII dan diet tinggi lemak. Diet tinggi lemak dibuat dengan cara menambahkan pakan standart BR-2 dengan lemak sebanyak 10% diblender dengan juicer tanpa penambahan air. Setiap kandang berisi dua ekor tikus dimana masing-masing dipisahkan oleh sekat yang terbuat dari kawat dimaksudkan untuk menjamin setiap tikus memperoleh jumlah pakan yang sama. Hal ini akan di lakukan selama proses induksi pakan aterogenik. Pakan aterogenik diberikan secara per oral dalam campuran pakan standar. 4.5.3 Persiapan Bahan Uji Bahan uji yang digunakan adalah daun srikaya (Annona squamosa) dan daun alpukat (Persea americana) yang diperoleh dari Pasuruan, Jawa Timur. Indentifikasi tanaman di lakukan di UPT Materima Medika, Batu.
43 4.5.4 Alur Penelitian Tikus putih jantan Rattus novergicus kontrol sehat Diadaptasi selama 7 hari Tikus K+, K-, P1, P2, dan P3 di beri pakan aterogenik selama 14 hari Di beri pakan standar K+ di beri Simvastatin 0,35 mg/150gbb K- di beri suspense CMC-Na 0,5 % P1 di beri ekstrak PA : AS dosis 1, yaitu 125 mg/kgbb : 125 mg/kgbb P2 di beri ekstrak PA : AS dosis 2, yaitu 125 mg/kgbb : 250 mg/kgbb P3 di beri ekstrak PA : AS dosis 3, yaitu 250 mg/kgbb : 125 mg/kgbb Perlakuan selama 21 hari Di ambil sampel darah di hari ke-22 Gambar Pengukuran 4.3Bagan kadar alur penelitian Triglisirida Analisis Data
44 4.6 Prosedur Kerja Tikus yang digunakan adalah tikus jantan Rattus norvegicus galur wistar bobot 130-180 gram berusia 70 hari sejumlah 30 ekor. Tikus lalu dibagi menjadi 6, masing-masing terdiri dari : 1. 4 ekor tikus sebagai kontrol sehat, diberi pakan standart selama penelitian 2. 4 ekor tikus kontrol negative (K-), yaitu tikus yang di beri pakan aterogenik selama 14 hari 3. 4 ekor tikus kontrol (K+), yaitu tikus yang di beri pakan aterogenik selama 14 hari dan di beri simvastatin dosis 10 kg/kgbb yang dikonversikan menjadi yaitu 0.135 mg/kgbb selama 21 hari 4. 4 ekor tikus perlakuan dosis 1 (P1), yaitu tikus yang di beri pakan aterogenik selama 14 hari dan di beri kombinasi ekstrak Persea americana dan Annona squamosa masing-masing 125 mg/kgbb dan 125 mg/kgbb selama 21 hari 5. 4 ekor tikus perlakuan dosis 2 (P2), yaitu tikus yang di beri pakan aterogenik selama 14 hari dan di beri kombinasi ekstrak Persea Americana dan Annona squamosa masing-masing 125 mg/kgbb dan 250 mg/kgbb selama 21 hari 6. 4 ekor tikus perlakuan dosis 3 (P3), yaitu tikus yang di beri pakan aterogenik selama 14 hari dan di beri kombinasi ekstrak Persea Americana dan Annona squamosa masing-masing 250 mg/kgbb dan 125 mg/kgbb selama 21 hari 4.7 Analisis Data Analisis data dalam penelitian ini yaitu dengan menggunakan metode One way ANOVA, yaitu analisis varian dimana terdapat variable numerik lebih dari dua, dalam penelitian ini yaitu tiga macam dosis kombinasi ekstrak daun alpukat dan srikaya. Metode ini menggunakan soft ware SPSS (Statistic Program for Social Science) 16.0 for windows. Sebelum pengolahan data harus di pastikan bahwa data yang di peroleh memiliki distribusi normal dan homogennitas sehingga dapat dipakai
45 dalam statistik parametik (statistic inferensial). Data yang memiliki normalitas yang baik adalah yang memiliki nilai signifikan >0.05 artinya tidak memiliki perbedaan yang signifikan sehingga data yang digunakan, sedangkan data yang bersifat homogeny memiliki signifikan >0.05. Kesimpulan penerimaan hipotesis dapat di lihat apabila nilai yang di peroleh dari hasil analisis yaitu <0.05.