TESIS AKTIVITAS ANTIBAKTERI Actinomycetes TERHADAP METHICILLIN RESISTANT Staphylococcus aureus (MRSA) NI MADE RANINGSIH PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015
TESIS AKTIVITAS ANTIBAKTERI Actinomycetes TERHADAP METHICILLIN RESISTANT Staphylococcus aureus (MRSA) NI MADE RANINGSIH NIM 1392261009 PROGRAM MAGISTER PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015 i
AKTIVITAS ANTIBAKTERI Actinomycetes TERHADAP METHICILLIN RESISTANT Staphylococcus aureus (MRSA) Tesis ini untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Biologi, Program Pascasarjana Universitas Udayana NI MADE RANINGSIH NIM 1392261009 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOLOGI PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015 ii
Lembar Pengesahan TESIS INI TELAH DISETUJUI TANGGAL 29 JUNI 2015 Pembimbing I, Pembimbing II, Dr. Dra. Retno Kawuri, M.Phil. NIP. 196101121988032002 Drs. I.B.Gede Darmayasa, M.Si. NIP. 196712031993031002 Mengetahui, Ketua Program Studi Magister Biologi Program Pascasarjana Universitas Udayana, Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana, Ir. Ida Ayu Astarini, M.Sc., Ph.D. NIP. 196803271993022001 Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K). NIP. 195902151985102001 iii
Tesis Ini Telah Diuji dan Dinilai Oleh Panitia Penguji Pada Tanggal 3 Juni 2015 Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana No : 1503/UN14.4/HK/2015 Tanggal : 26 Mei 2015 Panitia Penguji Tesis adalah : Ketua : Dr. Dra. Retno Kawuri, M.Phil Anggota : 1. Drs. I.B.Gede Darmayasa, M.Si 2. Drs. Yan Ramona, M.App.Sc.,PhD 3. DR. dr. I Dewa Made Sukrama, M.Si, Sp. MK (K) 4. Dra. Inna Narayani, M.Sc iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT Saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama : Ni Made Raningsih NIM : 1392261009 Program studi : Magister Biologi Judul Tesis : Aktivitas Antibakteri Actinomycetes Terhadap Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Dengan ini menyatakan bahwa tesis ini bebas plagiat. Apabila kemudian hari terbukti plagiat dalam tulisan ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai Peraturan Mendiknas RI No. 17 tahun 2010 dan Peraturan Perundang-undangan yang berlaku. Denpasar, Juni 2015 Yang membuat pernyataan Ni Made Raningsih v
UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur kehadapan Ida Sang Hyang Widhi, karena berkat anugerah- Nya lah penelitian yang berjudul Aktivitas Antibakteri Actinomycetes Terhadap Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) dapat diselesaikan. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Dra. Retno Kawuri, M.Phil, sebagai pembimbing I yang telah banyak memberikan arahan, bimbingan, dan dukungan moral kepada penulis selama penyusunan tesis ini. Ucapan yang sama juga ditujukan kepada Drs. I.B.Gede Darmayasa, M.Si, sebagai pembimbing II yang juga telah banyak memberikan arahan, bimbingan, dan dukungan moral kepada penulis selama penyusunan tesis ini. Ucapan yang sama juga ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. I ketut Suastika, Sp.Pd-KEMD atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis. Ucapan terima kasih ini juga ditujukan kepada Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S (K), selaku Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa program studi Magister Biologi. Ungkapan terima kasih kepada Ir. Ida Ayu Astarini, M.Sc., Ph.D, selaku Ketua Program Studi Magister Biologi Universitas Udayana yang telah memberikan ijin kepada penulis mengikuti pendidikan program magister Biologi pada Program Pascasarjana Universitas Udayana. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M.Si, selaku ketua Jurusan Biologi Universitas Udayana yang telah memberikan ijin dan fasilitas laboratorium kepada penulis untuk melakukan penelitian ini. Terima kasih juga kepada Dr. Dra. Meitini Wahyuni Proborini, M.Sc. St, sebagai pembimbing akademik yang telah membimbing dan memberikan dukungan moral hingga terselesaikannya tesis ini. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan pula kepada para penguji tesis yang telah memberikan kritik, saran, dan masukan sejak ujian usulan penelitian, yakni Drs. Yan Ramona, M.App.Sc.,PhD, DR. dr. I Dewa Made Sukrama, M.Si, Sp. MK (K), Dra. Inna Narayani, M.Sc vi
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih pula kepada Dr. Dra. Ni Putu Adriani Astiti, M.Si, sebagai dosen pengampu mata kuliah metabolit sekunder tumbuhan yang telah memberikan bimbingan dan arahan dalam penelitian ini. Ucapan yang sama juga ditujukan kepada Staff Laboratorium Mikrobiologi RSUP Sanglah Denpasar, yang telah banyak membantu dalam penelitian ini. Penulis juga ucapakan terima kasih kepada Orang tua dan temanteman, yang telah memberikan dukungan moral selama penyusunan tesis ini. Semoga Ida Sang Hyang Widi Wasa/ Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmatnya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini. Denpasar, Juni 2015 Penulis vii
ABSTRAK AKTIVITAS ANTIBAKTERI Actinomycetes TERHADAP METHICILLIN RESISTANT Staphylococcus aureus (MRSA) Resistensi bakteri patogen terhadap antibiotika merupakan salah satu hal yang menjadi masalah di bidang medis. Bakteri yang memiliki sifat resistensi terhadap beberapa antibiotika yaitu Staphylococcus aureus atau MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus). Dalam penelitian ini dilakukan upaya untuk pencarian antibiotika baru dengan memanfaatkan bakteri penghasil antibiotika yaitu dari golongan Actinomycetes. Tujuan dari penelitian ini adalah: 1) untuk mengisolasi isolat Actinomycetes dari tanah pada perkebunan cengkeh dan mengidentifikasi isolat Actinomycetes, 2) mengetahui potensi Actinomycetes dalam menghambat pertumbuhan MRSA secara in vitro, 3) untuk mengetahui MIC filtrat Actinomycetes yang paling berpotensi, dan 4) menganalisis senyawa aktif yang terkandung dalam filtrat isolat Actinomycetes. Dalam penelitian ini isolat MRSA diperoleh dari isolat penderita yang ada di RSUP Sanglah Denpasar dan diperoleh 7 isolat Actinomycetes yang diisolasi dari tanah pada perkebunan cengkeh di Desa Gitgit Kecamatan Sukasada. Semua isolat Actinomycetes bersifat Gram positif dan tidak tahan asam. Hasil identifikasi menggunakan buku Guide to The Classification and Identification of the Actinomycetes and Their Antibiotics (Lechevalier and Waksman, 1973) menunjukkan bahwa 6 isolat memiliki kemiripan terhadap genus Nocardia dan 1 isolat memiliki kemiripan terhadap genus Streptomyces. Hasil uji antagonis dengan metode dual culture pada media NA menunjukkan bahwa isolat Nocardia sp. dan Streptomyces sp. memiliki kemampuan yang berbeda dalam menghambat pertumbuhan MRSA. Isolat Nocardia sp.1 memiliki daya hambat yang paling besar dibandingkan isolat lainnya yaitu 22,7 mm. Filtrat Nocardia sp.1 memiliki MIC sebesar 2%. Hasil identifikasi senyawa yang terkandung dalam filtrat Nocardia sp.1 adalah 3,5 - Dichloro- 2 pyridone, Benzeneacetic acid, Hepatdecane, Phenol. 2.4-bis(1.1- dimethylethyl), Dodecanoic Acid Methyl Ester, Hexadecanoic Acid Methyl Ester, 1-(+)-Ascorbic Acid 2.6 Dihexadecanoate. Kata Kunci : Antibakteri, Actinomycetes, Nocardia sp., Methicillin Resistant Staphylococcus aureus. viii
ABSTRACT ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF Actinomycetes TO METHICILLIN RESISTANT Staphylococcus aureus (MRSA) The emergence of pathogenic bacterial resistance to antibiotics become an important issue in medical field nowadays. Staphylococcus aureus or MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) is one of which has resistent characteristics against several antibiotics. This research was intented to search any possible new antibiotic by using bacteria-producing antiobiotics e.g. Actinomycetes. The objectives of this research were: 1) identify and insulate the isolates of Actinomycetes generated from clove plantation soil, 2) recognize the potency of Actinomycetes on inhibiting the growth of MRSA in vitro, 3) discover the most potential Actinomycetes MIC filtrate, 4) and analyze the compound contained in the Actinomycetes isolates filtrate. MRSA isolates was generated from patients stay at RSUP Sanglah, Denpasar, while 7 Actinomycetes isolates were managed to be insulated from clove plantation soil at Gitgit village of district Sukasada. All Actinomycetes isolates samples was Gram positive and susceptible to acid. Identification using Guide to The Classification and Identification of the Actinomycetes and Their Antibiotics (Lechevalier and Waksman, 1973) showed that 6 Actinomycetes isolates was similar with genus Nocardia and 1 Actnomycetes isolate similiar with genus Streptomyces. The result of antagonist test using dual culture method on NA media showed that Nocardia sp. isolates and Streptomyces sp. isolate have different ability in response to inhibit the growth of MRSA. Nocardia sp.1 had the highest inhibition compared to others which was 22.7 mm, which has MIC about 2%. The compounds contained in Nocardia sp.1 filtrate were 3,5 Dichloro 2 pyridone, Benzeneacetic acid, Hepatdecane, Phenol. 2.4 bis(1.1-dimethylethyl), Dodecanoic Acid Methyl Ester, Hexadecanoic Acid Methyl Ester, 1 - (+) - Ascorbic Acid 2.6 Dihexadecanoate. Keywords : Antibacterial, Actinomycetes, Nocardia sp., Methicillin Resistant Staphylococcus aureus. ix
RINGKASAN Methicillin Resistance Staphylococcus aureus (MRSA) merupakan salah satu bakteri Gram positif yang resisten terhadap antibiotika. Mikroba ini telah resisten terhadap penisilin, oksasilin dan antibiotika beta laktam lainnya. Di Asia, S. aureus yang resisten terhadap siprofloksasin mencapai 37%. Persentase S. aureus yang telah resisten terhadap metisilin (MRSA) cukup tinggi di Asia, seperti di Taiwan mencapai 60%, Cina 20%, Hong Kong 70%, Filipina 5%, dan Singapura 60%. S. aureus dapat menyebabkan beberapa sindrom seperti bakterimia, infeksi saluran pernafasan, endokarditis, infeksi saluran urin, dan infeksi pada kulit. Saat ini diperlukan upaya dalam mengatasai hal tersebut. Selain berpedoman terhadap penggunaan antibiotika, pencarian antibiotika baru juga diperlukan. Actinomycetes merupakan kelompok terbesar sebagai sumber daya mikroba yang menghasilkan antibiotika dan juga memproduksi berbagai metabolit bioaktif nonantibiotika, seperti enzim, enzim inhibitor, dan regulator imunologi. Tujuan dari penelitian ini adalah 1. untuk mengetahui kemampuan isolat Actinomycetes yang diisolasi dari tanah pada perkebunan cengkeh yang mempunyai daya hambat terhadap pertumbuhan MRSA, 2. untuk mengetahui potensi filtrat Actinomycetes dalam menghambat pertumbuhan MRSA, 3. untuk mengetahui Minimum Inhibitory Concentration (MIC) filtrat antibiotika Actinomycetes, 4. untuk mengetahui jenis senyawa filtrat dari Actinomycetes. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi FMIPA Universitas Udayana yang dilakukan dari bulan November 2014-Februari 2015. Penelitian ini diawali dengan mengisolasi Actinomycetes dari tanah pada perkebunan cengkeh pada kedalam 15 cm dari permukaan tanah. Identifikasi isolat Actinomycetes dilakukan dengan menggunakan buku Guide to The Classification and Identification of the Actinomycetes and Their Antibiotics (Lechevalier and Waksman, 1973). Secara in vitro uji antagonis isolat Actinomycetes dilakukan dengan metode dual culture untuk mengetahui daya hambatnya. Sedangkan untuk mengetahui persentase minimum filtrat Actinomycetes yang paling berpotensi digunakan metode sumur difusi. Persentase filtrat yang digunakan yaitu 0%-100%. Untuk mengetahui senyawa aktif yang terkandung dalam filtrat Actinomycetes yang paling berpotensi dilakukan kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis sebelum diidentifikasi dengan menggunakan GCMS. Hasil penelitian menunjukkan dari tujuh isolat Actinomycetes yang berhasil diisolasi memiliki kemiripian dengan genus Nocardia dan genus Streptomyces. Isolat yang paling berpotensi dalam uji antagonis adalah isolat Nocardia sp.1 yang memiliki daya hambat lebih besar dibandingkan isolat lainnya yaitu sebesar 22,7 mm sehingga dilanjutkan untuk mengisolasi filtratnya. Uji filtrat Nocardia sp.1 terhadap MRSA mulai menunjukkan daya hambat pada persentase filtrat 10% kemudian konsentrasi diturunkan hingga 1% dan filtrat Nocardia sp.1 menujukkan daya hambat pada konsentrasi 2%. Menurut Adegboye and Babalola (2013) Actinomycetes mampu menghasilkan metabolit sekunder dalam akhir fase eksponensial, dimana metabolit yang dihasilkan dapat berupa antimikroba, toksin, pestisida, enzim. Beberapa mekanisme tersebut berkontribusi terhadap penghambatan yang x
dilakukan oleh Nocardia sp.1 terhadap MRSA. Senyawa yang teridentifikasi dari filtrat Nocardia sp. 1 yaitu 3,5 -Dichloro- 2 pyridone, Benzeneacetic acid, Hepatdecane, Phenol. 2.4-bis(1.1-dimethylethyl), Dodecanoic Acid Methyl Ester, Hexadecanoic Acid Methyl Ester, 1-(+)-Ascorbic Acid 2.6 Dihexadecanoate. Penelitian lain juga menemukan senyawa yang sama yang diisolasi dari Actinomycetes yaitu Benzeneacetic acid, Dodecanoic Acid Methyl Ester, Hexadecanoic Acid Methyl Ester. xi
DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... i PERSYARATAN GELAR... ii LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING... iii PENETAPAN PANITIA PENGUJI... iv SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT... v UCAPAN TERIMA KASIH... vi ABSTRAK... viii ABSTRACT... ix RINGKASAN... x DAFTAR ISI... xii DAFTAR GAMBAR... xiv DAFTAR TABEL... xv BAB I PENDAHULUAN... 1 1.1 Latar Belakang... 1 1.2 Rumusan Masalah... 3 1.3 Tujuan... 4 1.4 Manfaat... 4 BAB II KAJIAN PUSTAKA... 5 2.1 Actinomycetes... 5 2.2 Habitat dan keberadaan Actinomycetes... 6 2.3 Struktur Actinomycetes... 7 2.4 Pentingnya Actinomycetes... 8 2.5 Bakteri Staphylococcus aureus... 10 2.6 Antibiotika... 13 2.7 Mekanisme Kerja Antimikroba terhadap Bakteri... 14 2.8 Mekanisme Resistensi Bakteri Terhadap Antibiotika... 16 2.9 Minimum Inhibitory Concentration (MIC)... 18 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS PENELITIAN... 19 3.1 Kerangka Berpikir... 19 3.2 Konsep Penelitian... 21 3.3 Hipotesis... 22 BAB IV METODE PENELITIAN... 23 4.1 Rancangan Penelitian... 23 4.2 Lokasi dan waktu Penelitian... 23 4.3 Ruang Lingkup Penelitian... 23 4.5 Variabel Penelitian... 25 xii
4.5.1 Identifikasi dan klasifikasi variabel... 25 4.5.2 Definisi Operasional Variabel... 25 4.6 Bahan Penelitian... 26 4.7 Instrumen Penelitian... 26 4.8 Prosedur Penelitian... 27 4.8.1 Isolasi Actinomycetes... 27 4.8.2 Idenfikasi isolat Actinomycetes... 27 4.8.3 Uji aktivitas antagonis Actinomycetes terhadap Methicillin Resistance Staphylococcus aureus (MRSA)... 28 4.8.4 Penyiapan filtrat Actinomycetes... 28 4.8.5 Uji aktivitas filtrat Actinomycetes dengan metode sumur difusi... 29 4.8.6 Analisis senyawa dari filtrat Actinomycetes dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dan Gas Chromatography Mass Spectrometry GCMS... 30 4.9 Analisis Data... 30 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN... 32 5.1 Isolasi Actinomycetes Pada Perkebunan Cengkeh... 32 5.2 Hasil Identifikasi isolat Actinomycetes... 36 5.3 Aktivitas Antagonis Actinomycetes terhadap MRSA... 38 5.4 Aktivitas Filtrat Nocardia sp.1 terhadap MRSA... 41 5.5 Analisis senyawa dari filtrat Nocardia sp.1 dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dan Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS)... 47 BAB VI PENUTUP... 57 6.1 Simpulan... 57 6.2 Saran... 57 DAFTAR PUSTAKA... 59 LAMPIRAN... 68 xiii
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 3.1 Konsep Penelitian... 21 Gambar 4.1 Alur Rancangan Penelitian... 24 Gambar 5.1. (A) Koloni Actinomycetes C1 (B) Struktur mikroskopis... 32 Gambar 5.2.(A) Koloni Actinomycetes C2 (B) Struktur mikroskopis... 33 Gambar 5.3. (A) Koloni Actinomycetes C3 (B) Struktur mikroskopis... 34 Gambar 5.4. (A) Koloni Actinomycetes C4 (B) Struktur mikroskopis... 34 Gambar 5.5. (A) Koloni Actinomycetes C5 (B) Struktur mikroskopis... 35 Gambar 5.6. (A) Koloni Actinomycetes C6 (B) Struktur mikroskopis... 35 Gambar 5.7. (A) Koloni Actinomycetes C7 (B) Struktur mikroskopis... 36 Gambar 5.8. Daya Hambat Actinomycetes Terhadap MRSA... 39 Gambar 5.9. Daya hambat fase filtrat Nocardia sp.1 terhadap MRSA... 41 Gambar 5.10. Daya Hambat Filtrat Nocardia sp. 1 Terhadap Methicillin Resistance Staphylococcus aureus (MRSA)... 44 Gambar 5.11. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Fraksi II... 48 Gambar 5.12. Hasil uji fraksi Terhadap Methicillin Resistan Staphylococcus aureus (MRSA)... 48 Gambar 5.13. Kromatogram Hasil Analisis Fraksi Filtrat Actinomyecetes C1... 49 Gambar 5.14. Spektrum massa senyawa pada puncak 1... 50 Gambar 5.15. Spektrum massa senyawa pada puncak 2... 51 Gambar 5.16. Spektrum massa senyawa pada puncak 3... 52 Gambar 5.17. Spektrum massa senyawa pada puncak 5... 52 Gambar 5.18. Spektrum massa senyawa pada puncak 6... 53 Gambar 5.19. Spektrum massa senyawa pada puncak 7... 54 Gambar 5.20. Spektrum massa senyawa pada puncak 8... 54 xiv
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 2.1 Bakteri yang Termasuk Kelas Actinomycetes... 5 Tabel 2.2 Kelompok Dinding Sel Actinomycetes Berdasarkan Penyusun 8 Dinding Sel Utama... Tabel 5.1 Karakteristik Isolat Actinomycetes... 37 Tabel 5.2 Daya hambat isolat Actinomycetes terhadap Methicillin Resistance Staphylococcus aureus (MRSA)... 39 Tabel 5.3 Hasil Uji Daya Hambat Filtrat Nocardia sp.1 Dengan Konsentrasi 100%-1% (v/v) Terhadap Methicillin Resistance Staphylococcus aureus (MRSA)... 43 Tabel 5.4 Hasil fraksinasi filtrat Nocardia sp.1 menggunakan Kromatografi Kolom... 48 Tabel 5.5 Senyawa-Senyawa dari Masing-Masing Puncak Pada Kromatogram Fraksi Aktif Filtrat Nocardia sp.1... 49 xv