27 III MATERI DAN METODE PENELITIAN 3.1 Bahan Penelitian 3.1.1 Kulit Pisang Kapas Matang Kulit pisang yang digunakan adalah kulit Pisang Kapas matang yang berasal dari 3 pasar berbeda yaitu Pasar Induk Caringin Bandung, Pasar Induk Gedebage Bandung, dan Pasar Tanjungsari Sumedang. Kulit pisang dijemur hingga kering, kemudian dilakukan penggilingan dengan menggunakan hammer mil dengan ukuran saringan sebesar 20 mesh. Kemudian dilakukan analisis kandungan zat makanan terhadap kulit Pisang Kapas. Hasil analisis dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel.1 Kandungan Zat Makanan Kulit Pisang Kapas Matang Berdasarkan Bahan Kering Komponen Komposisi Bahan Kering (%) 54,00 Abu (%) 15,10 Protein Kasar (%) 11,70 Serat Kasar (%) 15,20 Lemak Kasar (%) 1,63 BETN (%) 56,30 TDN (%) 60,40 Energi (Kkl/kg) 3321 Tanin (%) 4,61 Sumber: Hasil analisa kimia Laboratorium Nutrisi Ternak Ruminansia dan Kimia Makanan Ternak Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran (2016). 3.1.2 Rumput Lapang Rumput lapang merupakan campuran dari beberapa jenis rumut lokal yang umumnya tumbuh secara alami (Pulungan, 1988). Rumput lapang diperoleh dari sekitaran kandang domba Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran. Jenis
28 rumput yang diperoleh yaitu Rumput Paitan, Rumput Bede, Rumput Pecut Kuda, Rumput Belulang, dan Rumput Patikan Kebo. Rumput dijemur hingga kering (BK ± 50%) kemudian digiling dengan menggunakan hammer mil dengan saringan berdiameter 20 mesh. Kemudian dilakukan analisis kandungan zat makanan pada rumput lapang. Hasil analisis tersebut dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Kandungan Zat Makanan Rumput Lapang berdasarkan Bahan Kering Komponen Komposisi Bahan kering (%) 21,85 Abu (%) 9,33 Protein (%) 9,10 Serat kasar (%) 28,76 Lemak kasar (%) 4,72 BETN (%) 48,09 TDN (%) 60,63 Energi (Kkl/kg) 2994 Sumber: Hasil analisa kimia Laboratorium Nutrisi Ternak Ruminansia dan Kimia Makanan Ternak Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran (2016). 3.1.3 Konsentrat Konsentrat yang digunakan berasal dari KPBS Pangalengan. Kandungan zat makanan dalam konsentrat dapat dilihat pada Tabel 3. 3.1.4 Cairan Rumen Cairan rumen yang digunakan sebagai media percobaan berasal dari domba lokal yang diperoleh dari peternakan rumah potong milik Pak Bandi yang berada di daerah Caringin.
29 Tabel 3. Kandungan Zat Makanan Konsentrat Komponen Komposisi Bahan kering (%) 92,68 Abu (%) 14,21 Protein (%) 13,76 Serat kasar (%) 18,76 Lemak kasar (%) 9,37 BETN (%) 43,90 TDN (%) 65,22 Energi (Kkl/kg) 3499 Sumber: KPBS Pangalengan 3.1.5 Saliva Buatan Larutan ini digunakan sebagai media buffer rumen in vitro. Larutan ini dibuat dengan menirukan kondisi ternak ruminansia sesungguhnya dan dibuat berdasarkan metode McDougall (1948). 3.1.6 Gas Karbondioksida (CO2) Gas karbondioksida digunakan untuk menghindari oksigen masuk ke dalam tabung fermentor pada saat memasukkan bahan atau ketika mengambil sampel in vitro agar mendekati kondisi sesungguhnya yaitu anaerob (Ogimoto dan Imai, 1981). 3.1.7 Larutan atau Reagen 1. NaCl Fisiologis digunakan sebagai larutan pengencer dalam perhitungan bakteri dan protozoa dengan tujuan agar bakteri dan protozoa tidak mengalami lisis sehingga bentuknya tetap utuh dan mudah diamati. 2. Aquadest digunakan untuk membersihkan alat dan bahan, pelarut dan pengencer. 3. Alkohol digunakan untuk sterilisasi alat-alat analisis bakteri dan protozoa.
30 3.2 Peralatan Penelitian 3.2.1 Peralatan Penelitian In Vitro 1. Timbangan Sartorius, untuk menimbang bahan pakan. 2. Peralatan pengambilan cairan rumen : a. Kain saring muslin, untuk menyaring cairan rumen. b. Termos yang berisi air hangat (39-40 C) untuk menyimpan cairan rumen selama perjalanan. c. Termometer, untuk mengukur suhu air termos 3. Seperangkat alat in vitro sebagai media inkubasi yaitu : a. Tabung fermentor Kapasitas 100 ml sebagai rumen tiruan dengan tutup karet berventil. b. Penangas air (water bath), sebagai tempat perendaman banung fermentor yang dilengkapi dengan pengatur suhu antara 39-40 C selama inkubasi. c. Tabung gas CO₂ beserta selang plastik, untuk menjaga keadaan tetap anaerob dengan cara dialirkan ke dalam tabung in vitro saat penuangan cairan rumen. 4. Alat ph meter untuk mengukur ph saliva bauatan. 5. Labu Erlenmeyer sebagai penampung saliva buatan. 6. Stirer untuk mengaduk saliva buatan. 7. Spuit, alat pengambil cairan supernatant. 8. Tabung film, tempat menyimpan cairan super natant 9. Seperangkat mikroskop untuk menghitung populasi protozoa.
31 10. Tabung Hungate, sebagai tabung inkubasi mikroba 3.2.2 Peralatan Pembuatan Tepung Kulit Pisang Kapas Matang 1. Timbangan Kapasitas 20 kg digunakan untuk menimbang kulit pisang, rumput lapang, dan konsentrat. 2. Terpal/karung digunakan untuk alas penjemuran kulit pisang, rumput lapang dan konsentrat. 3. Kantong plastik sampel digunakan untuk menyimpan masing-masing bahan sampel. 4. Box plastik untuk menyimpan seluruh bahan sampel agar tidak berserakan. 5. Mesin penggiling (hammer mill) digunakan untuk menggiling kulit pisang dan rumput lapang sehingga menjadi tepung. Ukuran saringan alat 20 mesh. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Prosedur Pembuatan Tepung Kulit Pisang Kapas Matang 1. Mengumpulkan Pisang Kapas dari pasar Caringin, Gedebage, dan Tanjungsari. 2. Mengupas Pisang Kapas dan memisahkan bagian kulitnya. 3. Menampung kulit Pisang Kapas dalam wadah atau baki. Kulit pisang dari tempat yang berbeda masing-masing ditimbang sebanyak 4 kg. 4. Menjemur masing-masing kulit Pisang Kapas di bawah sinar matahari sampai dengan kering. 5. Menggiling masing-masing kulit Pisang Kapas menggunakan hammer mill. 6. Mencampurkan masing-masing tepung kulit Pisang Kapas.
32 7. Menyimpan tepung kulit Pisang Kapas ke dalam toples. 8. Melakukan analisis proksimat kulit Pisang Kapas di laboratorium. 3.3.2 Prosedur Pembuatan Ransum Perlakuan 1. Menyiapkan bahan-bahan penyusun ransum yang terdiri atas rumput lapang, konsentrat dan tepung kulit Pisang Kapas matang. 2. Menimbang masing-masing bahan penyusun ransum yang telah digiling sesuai dengan presentase masing-masing perlakuan. Proporsi masingmasing bahan ditimbang untuk mencapai total campuran sebanyak 1 gram. 3. Memasukkan masing-masing bahan yang telah ditimbang ke dalam tabung fermentor dan mencampurnya dengan cara digoyang sampai homogen. 4. Susunan komposisi bahan dan zat makanan ransum perlakuan dapat dilihat pada Tabel berikut Tabel 4. Susunan dan Zat Makanan Ransum Penelitian Perlakuan Bahan Pakan R1 R2 R3 R4...%... 1. Komposisi bahan pakan a. Rumput lapang 50 40 30 20 b. Konsentrat 40 40 40 40 c. Kulit Pisang Kapas 10 20 30 40 2. Komposisi zat makanan* a. Protein kasar 11,20 11,46 11,72 11,98 b. Serat kasar 23,40 22,05 20,64 19,34 c. Lemak kasar 6,27 5,96 5,65 5,34 d. BETN 47,53 48,29 49,06 49,81 e. Abu 11,85 12,44 13,01 13,59 f. TDN 62,44 64,42 62,40 62,37 *berdasarkan hasil perhitungan
33 3.3.3 Prosedur Pelaksanaan Tahapan In Vitro 1. Pengambilan Cairan Rumen Termos dipanaskan dengan memasukkan air dengan suhu 39-40 C ke dalamnya, lalu diukur dengan thermometer agar sesuai dengan suhu rumen kemudian cairan rumen disaring dengan menggunakan kain muslin kemudian termos diisi penuh dengan cairan rumen agar tidak ada ruang kosong yang tersisa di dalam termos. 2. Pembuatan Larutan McDougall Larutan saliva buatan digunakan sebagai suatu medium buffer yang menyerupai kondisi rumen yang sesungguhnya yaitu 39-40 C, ph 6,5-6,8. Pembuatan saliva ini mengacu pada metode McDougall (1948) yang dikutip oleh Tilley and Terry (1963). 3. Pelaksanaan In Vitro Dalam penelitian ini metode yang digunakan mengacu pada metode Tilley and Terry (1963). Berikut ini urutan preparasi in vitro : 1. Menyiapkan semua alat yang akan digunakan dalam proses in vitro. 2. Menimbang 1 gram ransum percobaan dari setiap perlakuan kemudian dimasukkan kedalam tabung fermentor dan diberi label. 3. Mencampurkan saliva buatan dan cairan rumen ke dalam tabung in vitro yang telah berisi bahan substrat sebanyak 50 ml. 4. Mengalirkan CO₂ kedalam tabung, bertujuan agar kondisi tetap anaerob. 5. Menutup tabung fermentor dengan penutup karet pentil. 6. Menyimpan tabung fermentor kedalam rak yang telah tersedia dalam water bath dengan suhu air 39-40 C untuk inkubasi.
34 7. Tabung fermentor diinkubasi selama 24 jam dan setiap 3 jam sekali dilakukan pengocokan. 8. Tabung fermentor yang telah selesai diinkubasi dikocok sampai homogen kemudian ditetesi HgCl₂ sebanyak 3 tetes, dilakukan penyaringan dengan menggunakan kain saring musin. Cairan hasil penyaringan digunakan untuk menghitung jumlah bakteri dan protozoa yang terdapat di dalamnya. 3.3.4 Peubah yang Diamati Peubah yang diamati adalah total bakteri dan protozoa. Pengukuran populasi bakteri dan protozoa dihitung menggunakan metode Breed yang sudah dimodifikasi oleh Ruyitno (1988), dimana metode Breed seharusnya dilakukan dengan melakukan pewarnaan terhadap sampel menggunakan larutan MFS (Methylgreen Formaldehyde Saline) untuk populasi bakteri dan protozoa. Namun dapat dilakukan menggunakan mikroskop fluoresens untuk perhitungan bakteri dan protozoa dibuat dengan meneteskan satu tetes sampel hasil pengenceran dengan menggunakan mikro pipet tetes diatas object glass kemudian tutup dengan cover glass. Setelah itu dilakukan pengamatan bakteri dan protozoa dengan menggunakan mikroskop fluoresens dengan perbesaran 1000 kali, lalu dilakukan penandaan dengan melingkari daerah yang terdapat bakteri dan protozoa. Setelah dilakukan penandaan, software otomatis akan menghitung luas daerah lingkaran tersebut. Kemudian dilakukan perhitungan jumlah bakteri dan protozoa dalam luas daerah lingkaran secara manual. 1. Pengukuran Populasi Bakteri Pengukuran populasi bakteri prosedurnya sebagai berikut: a. Supernatan yang terdapat dalam tabung plastik diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet kemudian dimasukan ke dalam tabung reaksi.
35 b. Setelah itu dilakukan dengan pengenceran sampai 10-1 dengan menggunakan 9 ml NaCl fisiologis. c. Lalu preparat untuk perhitungan bakteri dibuat dengan meneteskan sebanyak 0,01 ml sampel hasil pengenceran dengan menggunakan mikro pipet di atas object glass kemudian ditutup dengan cover glass. d. Setelah itu dilakukan pengamatan bakteri dengan menggunakan mikroskop fluoresens dengan pembesaran 1000 kali, lalu dilakukan penandaan dengan melingkari daerah yang terdapat bakteri. Penandaan ini merupakan luas pandang mikroskop. Setelah dilakukan penandaan, software otomatis akan menghitung luas daerah lingkaran tersebut. Penandaan dilakukkan lebih dari satu dan populasi masing-masing dalam penandaan dijumlahkan dan diambil rata-ratanya. e. Kemudian dilakukan perhitungan jumlah bakteri dalam luas daerah lingkaran secara manual. f. Setelah jumlah bakteri dihitung, kemudian dilakukan perhitungan populasi bakteri (sel/mililiter cairan rumen) menggunakan rumus sebagai berikut: Keterangan: Luas cover glass = 20 mm x 20 mm = 400 mm 2 = 400 x 10 6 μm 2 Volume tetes = 0,01 ml FP = Faktor pengencer 2. Pengukuran Populasi Protozoa Pengukuran populasi protozoa prosedurnya sebagai berikut:
36 a. Supernatan yang terdapat dalam tabung plastik diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. b. Setelah itu dilakukan dengan pengenceran sampai 10-1 dengan menggunakan 9 ml NaCl fisiologis. c. Lalu preparat untuk perhitungan protozoa dibuat dengan meneteskan sebanyak 0,01 ml sampel hasil pengenceran dengan menggunakan mikro pipet di atas object glass kemudian ditutup dengan cover glass. d. Setelah itu dilakukan pengamatan protozoa dengan menggunakan mikroskop fluoresens dengan pembesaran 1000 kali, lalu dilakukan penandaan dengan melingkari daerah yang terdapat protozoa. Penandaan ini merupakan luas pandang mikroskop. Setelah dilakukan penandaan, software otomatis akan menghitung luas daerah lingkaran tersebut. Penandaan dilakukkan lebih dari satu dan populasi masing-masing dalam penandaan dijumlahkan dan diambil rata-ratanya. e. Kemudian dilakukan perhitungan jumlah protozoa dalam luas daerah lingkaran secara manual. f. Setelah jumlah protozoa dihitung, kemudian dilakukan perhitungan populasi protozoa (sel/mililiter cairan rumen) menggunakan rumus sebagai berikut: Keterangan: Luas cover glass = 20 mm x 20 mm = 400 mm 2 = 400 x 10 6 μm 2 Volume tetes = 0,01 ml FP = Faktor pengencer
37 3.4 Rancangan Percobaan dan Analisa Statistika Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL), terdiri atas empat perlakuan yaitu : R1 = R2 = R3 = R4 = 10% kulit Pisang Kapas matang + 50% rumput lapang + 40% konsentrat 20% kulit Pisang Kapas matang + 40% rumput lapang + 40% konsentrat 30% kulit Pisang Kapas matang + 30% rumput lapang + 40% konsentrat 40% kulit Pisang Kapas matang + 20% rumput lapang + 40% konsentrat Setiap perlakuan dilakukan pengulangan sebanyak 5 kali, sehingga diperoleh 20 satuan percobaan. Data kemudian diuji dengan sidik ragam dan uji jarak berganda Duncan. Adapun model matematika dan rancangan yang digunakan, yaitu model matematik menurut Gaspersz (1991) adalah sebagai berikut: Yij = + i + ij Keterangan : Yij i ij i j = Nilai pengamatan dari perlakuan ke-i ulangan ke-j = Nilai tengah populasi = Pengaruh perlakuan ke - i = Pengaruh acak perlakuan ke-i ulangan ke-j/galat = Perlakuan = Ulangan Hipotesis yang akan diuji adalah : H0 H1 : R1=R2=R3=R4. : Pengaruh perlakuan R1 R2 R3 R4 atau paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang berbeda.
38 Tabel 5. Sidik Ragam SK Db JK KT Fhit F0,05 Perlakuan (P) t-1= 3 JKP KTP KTP JK Galat (G) t(r-1)= 16 JKG KTG KTG KT Total tr-1= 19 JKT Keterangan : SK = Sumber Keragaman JK = Jumlah Kuadrat Db = Derajat Bebas KT = Kuadrat Tengah Kaidah keputusan : Jika Fhitung FTabel 0,05 maka tidak berbeda nyata (terima H0 dan tolak H1) Jika Fhitung > FTabel 0,05 maka berbeda nyata (tolak H0 dan terima H1) artinya ada pengaruh perlakuan terhadap respon yang diamati. Jika H0 diterima, berarti tidak ada pengaruh perlakuan yang berbeda, oleh karena itu pengujian lanjutan tidak perlu dilakukan, tetapi apabila H0 ditolak, berarti ada perlakuan yang berbeda, maka perlu dilakukan pengujian lanjut untuk mengetahui perbedaan diantara nilai tengah tersebut. Selanjutnya untuk menguji antar rata-rata perlakuan digunakan uji Jarak Berganda Duncan: Sx = LSR α = SSRα.Sx Keterangan: Sx : Standard error KTG : Kuadrat Tengah Galat SSR : Studentized Significant Range LSR : Least Significant Range r : Ulangan Selisih perlakuan (d) kemudian dibandingkan dengan perlakuan, dengan kaidah perlakuan 1. Apabila d LSR, tidak berbeda nyata (terima H0) 2. Apabila d LSR, berbeda nyata atau sangat nyata (tolak H0)
39 Tabel 6. Tata Letak Percobaan 1 P4U1 6 P2U3 11 P3U2 16 P1U5 Keterangan 2 P1U4 7 P3U1 12 P4U2 17 P2U5 3 P3U4 8 P1U3 13 P2U4 18 P4U3 4 P2U1 9 P4U4 14 P1U2 19 P3U5 5 P4U5 10 P3U3 15 P2U2 20 P1U1 P1 : Perlakuan 1 P2 : Perlakuan 2 P3 : Perlakuan 3 P4 : Perlakuan 4 U : Ulangan ke 1,2,3,4,5